nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін браузердің соңғы нұсқасын пайдалануды (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіруді) ұсынамыз. Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін бұл сайт стильдер мен JavaScript-тен бос болады.
Қаңқа бұлшықеті - негізінен миофибриллдерден тұратын гетерогенді тін, олар адамдарда әдетте үш түрге жіктеледі: біреуі «баяу» (1 тип) және екеуі «жылдам» (2А және 2X типтері). Дегенмен, дәстүрлі миофибрилл түрлері арасындағы және ішіндегі гетерогенділік әлі де нашар түсінілген. Біз адамның vastus lateralis-тен алынған 1050 және 1038 жеке миофибриллдерге транскриптомдық және протеомдық тәсілдерді қолдандық. Протеомдық зерттеуге ер адамдар қатысты, ал транскриптомдық зерттеуге 10 ер адам және 2 әйел қатысты. Миозиннің ауыр тізбекті изоформаларынан басқа, біз метаболикалық ақуыздарды, рибосомалық ақуыздарды және жасушалық түйіспелі ақуыздарды көп өлшемді интермиофибрилл өзгергіштігінің көздері ретінде анықтадық. Сонымен қатар, баяу және жылдам талшықтардың кластерлерін анықтауға қарамастан, біздің деректеріміз 2X типті талшықтардың басқа жылдам тартылатын талшықтардан фенотиптік тұрғыдан ажыратылмайтынын көрсетеді. Сонымен қатар, миозиннің ауыр тізбегіне негізделген жіктеу немалин миопатияларындағы миофибрилл фенотипін сипаттау үшін жеткіліксіз. Жалпы алғанда, біздің деректеріміз миофибралардың көп өлшемді гетерогенділігін көрсетеді, вариация көздері миозиннің ауыр тізбекті изоформаларынан тысқары.
Жасушалық гетерогенділік барлық биологиялық жүйелердің ажырамас ерекшелігі болып табылады, бұл жасушалардың тіндер мен жасушалардың әртүрлі қажеттіліктерін қанағаттандыру үшін мамандануына мүмкіндік береді.1 Қаңқа бұлшықет талшығының гетерогенділігі туралы дәстүрлі көзқарас моторлы нейрондар қозғалтқыш бірлігінің ішіндегі талшық түрін анықтайды және талшық түрі (яғни, адамдарда 1 тип, 2A типі және 2X типі) миозиннің ауыр тізбекті (MYH) изоформаларының сипаттамаларымен анықталады деген пікірде болды.2 Бұл бастапқыда олардың рН АТФаза тұрақсыздығына,3,4 және кейінірек MYH молекулалық экспрессиясына негізделген.5 Дегенмен, әртүрлі пропорцияларда бірнеше MYH-ті бірге экспрессиялайтын «аралас» талшықтарды анықтау және кейіннен қабылдау арқылы қаңқа бұлшықет талшықтары жеке талшық түрлері ретінде емес, континуум ретінде қарастырыла бастады.6 Осыған қарамастан, бұл сала әлі де миофибрлерді жіктеудің негізгі жіктеушісі ретінде MYH-ға қатты сүйенеді, бұл көзқарас, мүмкін, MYH экспрессиясының профильдері мен талшық түрлерінің диапазоны адамдардағыдан өзгеше болатын ерте кеміргіштерді зерттеудің шектеулері мен маңызды ауытқуларына байланысты.2 Жағдайды адамның әртүрлі қаңқа бұлшықеттері талшық түрлерінің алуан түрлілігін көрсететіндігі одан әрі күрделендіреді.7 vastus lateralis – MYH экспрессиясының аралық (және сондықтан репрезентативті) профилі бар аралас бұлшықет.7 Сонымен қатар, сынама алудың қарапайымдылығы оны адамдардағы ең жақсы зерттелген бұлшықет етеді.
Осылайша, қуатты «омикс» құралдарын қолдана отырып, қаңқа бұлшықет талшықтарының әртүрлілігін объективті зерттеу өте маңызды, бірақ сонымен бірге қиын, бұл ішінара қаңқа бұлшықет талшықтарының көп ядролы табиғатына байланысты. Дегенмен, транскриптомика8,9 және протеомика10 технологиялары соңғы жылдары әртүрлі технологиялық жетістіктерге байланысты сезімталдықта төңкеріс жасады, бұл қаңқа бұлшықеттерін бір талшықты ажыратымдылықта талдауға мүмкіндік береді. Нәтижесінде, бір талшықты әртүрлілікті және олардың атрофиялық тітіркендіргіштер мен қартаюға реакциясын сипаттауда айтарлықтай прогреске қол жеткізілді11,12,13,14,15,16,17,18. Маңыздысы, бұл технологиялық жетістіктердің клиникалық қолданылуы бар, бұл аурумен байланысты дисрегуляцияны егжей-тегжейлі және дәл сипаттауға мүмкіндік береді. Мысалы, ең көп таралған тұқым қуалайтын бұлшықет ауруларының бірі (MIM 605355 және MIM 161800) немалин миопатиясының патофизиологиясы күрделі және шатастырады19,20 Сондықтан, қаңқа бұлшықет талшықтарының дисрегуляциясын жақсырақ сипаттау бұл ауруды түсінуімізде айтарлықтай жетістіктерге әкелуі мүмкін.
Біз адам биопсиясының үлгілерінен қолмен оқшауланған жеке қаңқа бұлшықет талшықтарының транскриптомдық және протеомдық талдау әдістерін әзірледік және оларды мыңдаған талшықтарға қолдандық, бұл бізге адам қаңқа бұлшықет талшықтарының жасушалық гетерогенділігін зерттеуге мүмкіндік берді. Бұл жұмыс барысында біз бұлшықет талшықтарының транскриптомдық және протеомдық фенотиптеу күшін көрсеттік және метаболикалық, рибосомалық және жасушалық түйіспелі ақуыздарды талшықтар аралық өзгергіштіктің маңызды көздері ретінде анықтадық. Сонымен қатар, осы протеомдық жұмыс процесін қолдана отырып, біз жеке қаңқа бұлшықет талшықтарындағы нематодты миопатияның клиникалық маңыздылығын сипаттадық, MYH негізінде талшық түріне тәуелсіз тотықсыз талшықтарға қарай үйлесімді ауысуды анықтадық.
Адамның қаңқа бұлшықет талшықтарының гетерогенділігін зерттеу үшін біз жеке қаңқа бұлшықет талшықтарының транскриптом және протеом талдауын жүргізуге мүмкіндік беретін екі жұмыс процесін әзірледік (1A сурет және қосымша 1A сурет). Біз үлгіні сақтаудан және РНҚ мен ақуыз тұтастығын сақтаудан бастап, әрбір тәсіл үшін өткізу қабілетін оңтайландыруға дейінгі бірнеше әдіснамалық қадамдарды әзірлеп, оңтайландырдық. Транскриптом талдауы үшін бұл кері транскрипцияның бастапқы кезеңінде үлгіге тән молекулалық штрих-кодтарды енгізу арқылы қол жеткізілді, бұл тиімді төменгі ағынды өңдеу үшін 96 талшықты біріктіруге мүмкіндік берді. Дәстүрлі бір жасушалы тәсілдермен салыстырғанда тереңірек секвенирлеу (әр талшыққа ±1 миллион оқу) транскриптом деректерін одан әрі байытты.21 Протеомика үшін біз жоғары өткізу қабілетін сақтай отырып, протеом тереңдігін оңтайландыру үшін timsTOF масс-спектрометрінде DIA-PASEF деректерін алумен біріктірілген қысқа хроматографиялық градиентті (21 минут) қолдандық. 22,23 Сау қаңқа бұлшықет талшықтарының гетерогенділігін зерттеу үшін біз 14 сау ересек донордан алынған 1050 жеке талшықтың транскриптомдарын және 5 сау ересек донордан алынған 1038 талшықтың протеомдарын сипаттадық (1-қосымша кесте). Бұл мақалада бұл деректер жиынтығы сәйкесінше 1000 талшықты транскриптомдар және протеомдар деп аталады. Біздің тәсіліміз 1000 талшықты транскриптомдық және протеомдық талдауларда барлығы 27 237 транскрипт пен 2983 ақуызды анықтады (1А сурет, 1-2 қосымша деректер жиынтығы). Транскриптомдық және протеомдық деректер жиынтығын >1000 анықталған гендер және әрбір талшық үшін 50% жарамды мәндер үшін сүзгіден өткізгеннен кейін, транскриптом мен протеомдағы 925 және 974 талшық үшін биоинформатикалық талдаулар жүргізілді. Сүзуден кейін әр талшықтан орта есеппен 4257 ± 1557 ген және 2015 ± 234 ақуыз (орташа ± SD) анықталды, жеке аралық өзгергіштік шектеулі болды (1B–C қосымша суреттері, 3–4 қосымша деректер жиынтығы). Дегенмен, субъекті ішіндегі өзгергіштік қатысушылар арасында айқынырақ болды, бұл әртүрлі ұзындықтағы және көлденең қима аудандарындағы талшықтар арасындағы РНҚ/ақуыз өнімділігінің айырмашылықтарына байланысты болуы мүмкін. Көптеген ақуыздар үшін (>2000) вариация коэффициенті 20%-дан төмен болды (1D қосымша сурет). Екі әдіс те бұлшықеттің жиырылуы үшін маңызды жоғары экспрессияланған қолтаңбалары бар транскрипттер мен ақуыздардың кең динамикалық диапазонын түсіруге мүмкіндік берді (мысалы, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (1E–F қосымша суреттері). Анықталған белгілердің көпшілігі транскриптомиялық және протеомиялық деректер жиынтықтары арасында ортақ болды (1G қосымша сурет), және бұл белгілердің орташа UMI/LFQ қарқындылығы жақсы корреляцияланған (r = 0,52) (1H қосымша сурет).
Транскриптомика және протеомика жұмыс процесі (BioRender.com көмегімен жасалған). BD MYH7, MYH2 және MYH1 үшін динамикалық диапазон қисықтары және талшық түрін тағайындау үшін есептелген шектік мәндер. E, F Транскриптомика және протеомика деректер жиынтықтарындағы MYH экспрессиясының талшықтар бойынша таралуы. G, H MYH негізіндегі талшық түрімен боялған транскриптомика және протеомика үшін біркелкі әртүрлілік жуықтау және проекциялау (UMAP) графиктері. I, J Транскриптомика және протеомика деректер жиынтықтарындағы MYH7, MYH2 және MYH1 экспрессиясын көрсететін ерекшелік графиктері.
Бастапқыда біз әрбір талшыққа MYH негізіндегі талшық түрін тағайындауды мақсат еттік, ол omics деректер жиынтықтарындағы MYH экспрессиясының жоғары сезімталдығы мен динамикалық диапазонын пайдаланады. Алдыңғы зерттеулерде талшықтарды таза 1 типті, 2A типті, 2X типті немесе әртүрлі MYH экспрессиясының белгіленген пайызына негізделген аралас деп белгілеу үшін кез келген шекті мәндер қолданылған11,14,24. Біз әр талшықтың экспрессиясы талшықтарды теру үшін қолданған MYH бойынша бағаланатын басқа тәсілді қолдандық: MYH7, MYH2 және MYH1, сәйкесінше 1 типті, 2A типті және 2X типті талшықтарға сәйкес келеді. Содан кейін біз әрбір алынған қисықтың төменгі иілу нүктесін математикалық түрде есептеп, оны әрбір MYH үшін талшықтарды оң (шекті мәннен жоғары) немесе теріс (шекті мәннен төмен) ретінде тағайындау үшін шекті мән ретінде пайдаландық (1B-D сурет). Бұл деректер MYH7 (1B сурет) және MYH2 (1C сурет) ақуыз деңгейімен салыстырғанда РНҚ деңгейінде қосу/өшіру экспрессиясының айқынырақ профильдеріне ие екенін көрсетеді. Шынында да, ақуыз деңгейінде өте аз талшықтар MYH7 экспрессиясын көрсетпеді, және ешбір талшықта 100% MYH2 экспрессиясы болмады. Әрі қарай біз әрбір деректер жиынтығындағы барлық талшықтарға MYH негізіндегі талшық түрлерін тағайындау үшін алдын ала анықталған экспрессия шектерін қолдандық. Мысалы, MYH7+/MYH2-/MYH1- талшықтары 1-типке жатқызылды, ал MYH7-/MYH2+/MYH1+ талшықтары аралас 2A/2X типіне жатқызылды (толық сипаттама үшін 2-қосымша кестені қараңыз). Барлық талшықтарды біріктіре отырып, біз MYH негізіндегі талшық түрлерінің РНҚ (1E сурет) және ақуыз (1F сурет) деңгейлерінде таңқаларлықтай ұқсас таралуын байқадық, ал MYH негізіндегі талшық түрлерінің салыстырмалы құрамы күтілгендей жеке адамдар арасында өзгеріп отырды (2A қосымша сурет). Көптеген талшықтар таза 1 типті (34–35%) немесе 2A типті (36–38%) деп жіктелді, дегенмен аралас 2A/2X типті талшықтардың айтарлықтай саны да анықталды (16–19%). Таңқаларлық айырмашылық - таза 2X типті талшықтарды тек РНҚ деңгейінде анықтауға болады, бірақ ақуыз деңгейінде емес, бұл MYH экспрессиясының транскрипциядан кейін кем дегенде ішінара реттелетінін көрсетеді.
Біз протеомикаға негізделген MYH талшықтарын типтеу әдісін антиденелерге негізделген нүктелік блоттауды қолдана отырып тексердік және екі әдіс те таза 1 типті және 2A типті талшықтарды анықтауда 100% келісімге қол жеткізді (қосымша 2B суретін қараңыз). Дегенмен, протеомикаға негізделген тәсіл аралас талшықтарды анықтауда және әрбір талшықтағы әрбір MYH генінің үлесін сандық бағалауда сезімталырақ, тиімдірек болды. Бұл деректер қаңқа бұлшықет талшықтарының түрлерін сипаттау үшін объективті, жоғары сезімтал омикаға негізделген тәсілді қолданудың тиімділігін көрсетеді.
Содан кейін біз транскриптомика мен протеомика ұсынған біріктірілген ақпаратты пайдаланып, миофибраларды олардың толық транскриптомына немесе протеомына негізделген объективті түрде жіктедік. Өлшемділікті алты негізгі компонентке дейін азайту үшін біркелкі көпжақты жуықтау және проекциялау (UMAP) әдісін қолдана отырып (3A–B қосымша суреттер), біз транскриптомдағы (1G сурет) және протеомдағы (1H сурет) миофибралардың өзгергіштігін көре алдық. Атап айтқанда, миофибраларды транскриптомика немесе протеомика деректер жиынтықтарында қатысушылар (3C–D қосымша суреттер) немесе сынақ күндері (3E қосымша сурет) бойынша топтастырмаған, бұл қаңқа бұлшықет талшықтарындағы субъектішілік өзгергіштік субъектілер арасындағы өзгергіштікке қарағанда жоғары екенін көрсетеді. UMAP графигінде «жылдам» және «баяу» миофибраларды білдіретін екі бөлек кластер пайда болды (1G–H суреттер). MYH7+ (баяу) миофабралары UMAP1 оң полюсінде топтастырылды, ал MYH2+ және MYH1+ (жылдам) миофабралары UMAP1 теріс полюсінде топтастырылды (1I–J суреттер). Дегенмен, MYH экспрессиясына негізделген жылдам жиырылатын талшық түрлері (яғни, 2A типі, 2X типі немесе аралас 2A/2X) арасында ешқандай айырмашылық жасалмады, бұл MYH1 (1I–J суреті) немесе ACTN3 немесе MYLK2 (қосымша 4A–B суреттері) сияқты басқа классикалық 2X миофабра маркерлерінің экспрессиясы бүкіл транскриптомды немесе протеомды қарастырған кезде әртүрлі миофабра түрлерін ажыратпайтынын көрсетеді. Сонымен қатар, MYH2 және MYH7-мен салыстырғанда, MYH1-мен оң корреляцияланған транскрипттер немесе ақуыздар аз болды (қосымша 4C–H суреттері), бұл MYH1 молдығы миофабра транскриптомын/протеомын толық көрсетпейтінін көрсетеді. UMAP деңгейіндегі үш MYH изоформасының аралас экспрессиясын бағалау кезінде ұқсас қорытындыларға қол жеткізілді (4I–J қосымша суреттер). Осылайша, 2X талшықтарын тек MYH сандық анықтау негізінде транскрипт деңгейінде анықтауға болатын болса, MYH1+ талшықтары транскриптомды немесе протеомды толығымен қарастырған кезде басқа жылдам талшықтардан ажыратылмайды.
MYH-тан тыс баяу талшықтардың гетерогенділігін бастапқы зерттеу ретінде біз төрт белгіленген баяу талшық түріне тән ақуыздарды бағаладық: TPM3, TNNT1, MYL3 және ATP2A22. Баяу талшықтардың кіші түрлері транскриптомикада (5A қосымша сурет) және протеомикада (5B қосымша сурет) MYH7-мен жоғары, бірақ мінсіз емес Пирсон корреляциясын көрсетті. Баяу талшықтардың шамамен 25% және 33% транскриптомикада (5C қосымша сурет) және протеомикада (5D қосымша сурет) барлық ген/ақуыз кіші түрлері бойынша таза баяу талшықтар ретінде жіктелмеді. Сондықтан, бірнеше ген/ақуыз кіші түрлеріне негізделген баяу талшықтарды жіктеу, тіпті талшық түріне тән екені белгілі ақуыздар үшін де қосымша күрделілікті тудырады. Бұл бір ген/ақуыз тұқымдасының изоформаларына негізделген талшықтарды жіктеу қаңқа бұлшықет талшықтарының шынайы гетерогенділігін жеткілікті түрде көрсетпеуі мүмкін екенін көрсетеді.
Адам қаңқа бұлшықет талшықтарының фенотиптік өзгергіштігін толық омика моделінің масштабында одан әрі зерттеу үшін біз негізгі компоненттік талдауды (PCA) қолдана отырып, деректердің өлшемділігін объективті түрде төмендеттік (2A сурет). UMAP графиктеріне ұқсас, қатысушы да, сынақ күні де PCA деңгейіндегі талшықтардың кластерленуіне әсер еткен жоқ (6A–C қосымша суреттер). Екі деректер жиынтығында да MYH негізіндегі талшық түрі PC2 арқылы түсіндірілді, ол баяу тартылатын 1 типті талшықтардың кластерін және жылдам тартылатын 2A типті, 2X типті және аралас 2A/2X талшықтарын қамтитын екінші кластерді көрсетті (2A сурет). Екі деректер жиынтығында да бұл екі кластер аралас 1/2A типті талшықтардың аз санымен байланысты болды. Күтілгендей, негізгі PC драйверлерінің шамадан тыс көрсетілуін талдау PC2 жиырылу және метаболикалық қолтаңбалармен басқарылатынын растады (2B сурет және 6D–E қосымша суреттері, 5–6 қосымша деректер жиынтығы). Жалпы алғанда, MYH негізіндегі талшық түрі PC2 бойындағы үздіксіз вариацияны түсіндіруге жеткілікті болып шықты, жылдам кластер ішіндегі транскриптом бойынша таралған 2X талшықтарын қоспағанда.
A. MYH негізінде талшық түріне қарай боялған транскриптом және протеом деректер жиынтықтарының негізгі компоненттік талдау (PCA) графиктері. B. PC2 және PC1 транскрипт және ақуыз драйверлерін байыту талдауы. Статистикалық талдау clusterProfiler пакетін және Benjamini-Hochberg түзетілген p-мәндерін пайдаланып жүргізілді. C, D. Транскриптомдағы жасушааралық адгезия генінің онтологиясы (GO) терминдеріне және протеомдағы костамера GO терминдеріне сәйкес боялған PCA графиктері. Көрсеткілер транскрипт және ақуыз драйверлерін және олардың бағыттарын білдіреді. E, F. Баяу/жылдам талшық түріне тәуелсіз экспрессия градиенттерін көрсететін клиникалық тұрғыдан маңызды белгілердің біркелкі көпжақты жуықтау және проекциялау (UMAP) графиктері. G, H. Транскриптомдар мен протеомдардағы PC2 және PC1 драйверлері арасындағы корреляциялар.
Күтпеген жерден, MYH негізіндегі миофибра түрі өзгергіштіктің екінші ең жоғары дәрежесін (PC2) ғана түсіндірді, бұл MYH негізіндегі миофибра түріне (PC1) қатысы жоқ басқа биологиялық факторлардың қаңқа бұлшықет талшығының гетерогенділігін реттеуде маңызды рөл атқаратынын көрсетеді. PC1-дегі негізгі драйверлердің шамадан тыс көрсетілуін талдау PC1-дегі өзгергіштік негізінен транскриптомдағы жасуша-жасуша адгезиясымен және рибосома құрамымен, сондай-ақ протеомдағы костамералар мен рибосомалық ақуыздармен анықталатынын көрсетті (2B сурет және 6D–E қосымша суреттері, 7-қосымша деректер жиынтығы). Қаңқа бұлшықетінде костамералар Z-дискіні сарколеммамен байланыстырады және күш беру мен сигнал беруге қатысады. 25 Жасуша-жасуша адгезиясын (транскриптом, 2C сурет) және костамера (протеом, 2D сурет) пайдаланатын аннотацияланған PCA графиктері PC1-де солға қарай күшті ығысуды анықтады, бұл бұл ерекшеліктердің белгілі бір талшықтармен байытылғанын көрсетеді.
UMAP деңгейіндегі миофибралардың кластерленуін егжей-тегжейлі зерттеу көптеген белгілердің миофибралардың субкластерлік емес, миофибралардың түріне тәуелсіз MYH негізіндегі экспрессия градиентін көрсететінін көрсетті. Бұл үздіксіздік патологиялық жағдайлармен байланысты бірнеше гендер үшін байқалды (2E сурет), мысалы, CHCHD10 (жүйке-бұлшықет ауруы), SLIT3 (бұлшықет атрофиясы), CTDNEP1 (бұлшықет ауруы). Бұл үздіксіздік неврологиялық бұзылулармен (UGDH), инсулин сигнализациясымен (PHIP) және транскрипциямен (HIST1H2AB) байланысты ақуыздарды қоса алғанда, протеом бойынша да байқалды (2F сурет). Жалпы алғанда, бұл деректер әртүрлі миофибралардың талшық түріне тәуелсіз баяу/жылдам жиырылу гетерогенділігіндегі үздіксіздікті көрсетеді.
Қызығы, PC2 жасушасындағы драйвер гендер транскриптом-протеом корреляциясын жақсы көрсетті (r = 0,663) (2G-сурет), бұл баяу және жылдам жиырылатын талшық түрлерінің, атап айтқанда, қаңқа бұлшықет талшықтарының жиырылу және метаболикалық қасиеттерінің транскрипциялық реттелетінін көрсетеді. Дегенмен, PC1 жасушасындағы драйвер гендерінде транскриптом-протеом корреляциясы көрсетілмеді (r = -0,027) (2H-сурет), бұл баяу/жылдам жиырылатын талшық түрлеріне қатысы жоқ вариациялардың транскрипциядан кейін негізінен реттелетінін көрсетеді. PC1 жасушасындағы вариациялар негізінен рибосомалық ген онтологиясы терминдерімен түсіндірілгендіктен және рибосомалар ақуыз аудармасына белсенді қатысу және әсер ету арқылы жасушада маңызды және мамандандырылған рөл атқаратынын ескере отырып,31 біз келесіде осы күтпеген рибосомалық гетерогенділікті зерттеуге кірісеміз.
Біз алдымен протеомиканың негізгі компонентін талдау графигін GOCC «цитоплазмалық рибосома» терминіндегі ақуыздардың салыстырмалы молдығына сәйкес боядық (3A сурет). Бұл термин PC1 оң жағында байытылғанымен, шағын градиентке әкелсе де, рибосомалық ақуыздар PC1 екі бағытта да бөлінуді тудырады (3A сурет). PC1 теріс жағында байытылған рибосомалық ақуыздарға RPL18, RPS18 және RPS13 кірді (3B сурет), ал RPL31, RPL35 және RPL38 (3C сурет) PC1 оң жағындағы негізгі қозғаушы күштер болды. Қызығы, RPL38 және RPS13 басқа тіндермен салыстырғанда қаңқа бұлшықетінде жоғары экспрессияланды (7A қосымша сурет). PC1-дегі бұл ерекше рибосомалық қолтаңбалар транскриптомда байқалмады (7B қосымша сурет), бұл транскрипциядан кейінгі реттеуді көрсетеді.
A. Протеом бойынша цитоплазмалық рибосомалық ген онтологиясы (GO) терминдеріне сәйкес боялған негізгі компонентті талдау (PCA) графигі. Көрсеткілер PCA графигіндегі ақуыз арқылы өзгеру бағытын көрсетеді. Сызық ұзындығы берілген ақуыздың негізгі компоненттік ұпайына сәйкес келеді. B, C. PCA RPS13 және RPL38 үшін графиктерді белгілейді. D. Цитоплазмалық рибосомалық ақуыздардың бақыланбайтын иерархиялық кластерлік талдауы. E. Қаңқа бұлшықет талшықтарында әртүрлі мөлшердегі рибосомалық ақуыздарды көрсететін 80S рибосомасының (PDB: 4V6X) құрылымдық моделі. F. мРНҚ шығу каналының жанында орналасқан әртүрлі стехиометриясы бар рибосомалық ақуыздар.
Рибосомалық гетерогенділік және мамандану тұжырымдамалары бұрын ұсынылған болатын, мұнда әртүрлі рибосома субпопуляцияларының болуы (рибосомалық гетерогенділік) әртүрлі тіндердегі ақуыздың аударылуына тікелей әсер етуі мүмкін32 және жасушалар33 нақты мРНҚ транскрипт пулдарының34 селективті аудармасы арқылы (рибосома мамандануы). Қаңқа бұлшықет талшықтарында бірге экспрессияланған рибосомалық ақуыздардың субпопуляцияларын анықтау үшін біз протеомдағы рибосомалық ақуыздардың бақыланбайтын иерархиялық кластерлік талдауын жүргіздік (3D сурет, Қосымша деректер жиынтығы 8). Күтілгендей, рибосомалық ақуыздар MYH негізінде талшық түрі бойынша кластерленбеді. Дегенмен, біз рибосомалық ақуыздардың үш түрлі кластерін анықтадық; бірінші кластер (ribosomal_cluster_1) RPL38-мен бірге реттеледі және сондықтан оң PC1 профилі бар талшықтарда экспрессия жоғарылаған. Екінші кластер (ribosomal_cluster_2) RPS13-пен бірге реттеледі және теріс PC1 профилі бар талшықтарда жоғарылайды. Үшінші кластер (ribosomal_cluster_3) қаңқа бұлшықет талшықтарында үйлестірілген дифференциалды экспрессияны көрсетпейді және оны «негізгі» қаңқа бұлшықетінің рибосомалық ақуызы деп санауға болады. 1 және 2 рибосомалық кластерлердің екеуі де бұрын балама трансляцияны реттейтіні көрсетілген рибосомалық ақуыздарды қамтиды (мысалы, RPL10A, RPL38, RPS19 және RPS25) және дамуға функционалды түрде әсер етеді (мысалы, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA нәтижелеріне сәйкес, бұл рибосомалық ақуыздардың талшықтардағы гетерогенді көрінісі де үздіксіздікті көрсетті (қосымша 7C сурет).
Рибосома ішіндегі гетерогенді рибосомалық ақуыздардың орналасуын визуализациялау үшін біз адам 80S рибосомасының құрылымдық моделін қолдандық (Ақуыз деректер банкі: 4V6X) (3E сурет). Әртүрлі рибосомалық кластерлерге жататын рибосомалық ақуыздарды бөліп алғаннан кейін, олардың орналасуы бір-біріне жақын орналаспаған, бұл біздің тәсіліміздің рибосоманың белгілі бір аймақтары/фракциялары үшін байытуды қамтамасыз ете алмағанын көрсетеді. Дегенмен, қызығы, 2-ші кластердегі ірі суббірлік ақуыздарының үлесі 1 және 3-ші кластерлерге қарағанда төмен болды (қосымша 7D сурет). Біз қаңқа бұлшықет талшықтарындағы стехиометриясы өзгертілген ақуыздардың негізінен рибосома бетінде орналасқанын байқадық (3E сурет), бұл олардың әртүрлі мРНҚ популяцияларындағы рибосоманың ішкі кіру орнының (IRES) элементтерімен әрекеттесу қабілетіне сәйкес келеді, осылайша селективті трансляцияны үйлестіреді.40, 41 Сонымен қатар, қаңқа бұлшықет талшықтарындағы стехиометриясы өзгертілген көптеген ақуыздар мРНҚ шығу туннелі сияқты функционалды аймақтардың жанында орналасқан (3F сурет), олар белгілі бір пептидтердің трансляциялық ұзаруын және тоқтауын селективті түрде реттейді. 42 Қорытындылай келе, біздің деректеріміз қаңқа бұлшықетінің рибосомалық ақуыздарының стехиометриясы гетерогенділікті көрсететінін, нәтижесінде қаңқа бұлшықет талшықтары арасында айырмашылықтар пайда болатынын көрсетеді.
Келесі кезекте біз жылдам және баяу жиырылатын талшықтардың қолтаңбаларын анықтауға және олардың транскрипциялық реттелу механизмдерін зерттеуге кірісеміз. Екі деректер жиынтығында (1G-H және 4A-B суреттер) UMAP арқылы анықталған жылдам және баяу жиырылатын талшық кластерлерін салыстыра отырып, транскриптомиялық және протеомикалық талдаулар сәйкесінше 1366 және 804 дифференциалды мол ерекшеліктерді анықтады (4A-B суреттері, Қосымша деректер жиынтығы 9-12). Біз саркомерлерге (мысалы, тропомиозин және тропонин), қоздыру-жиырылу байланысына (SERCA изоформалары) және энергия алмасуына (мысалы, ALDOA және CKB) қатысты қолтаңбалардағы күтілетін айырмашылықтарды байқадық. Сонымен қатар, ақуыз убиквитинденуін реттейтін транскрипттер мен ақуыздар жылдам және баяу жиырылатын талшықтарда (мысалы, USP54, SH3RF2, USP28 және USP48) дифференциалды түрде экспрессияланды (4A-B суреттер). Сонымен қатар, бұрын қой етінің бұлшықет талшығының түрлерінде43 дифференциалды түрде экспрессияланатыны және жүрек бұлшықетінде44 SERCA белсенділігін арттыратыны көрсетілген RP11-451G4.2 микробтық ақуыз гені (DWORF) баяу қаңқа бұлшықет талшықтарында айтарлықтай жоғарылаған (4A сурет). Сол сияқты, жеке талшық деңгейінде метаболизмге байланысты лактатдегидрогеназа изоформалары (LDHA және LDHB, 4C сурет және 8A қосымша сурет)45,46 сияқты белгілі белгілерде, сондай-ақ бұрын белгісіз талшық түріне тән белгілерде (мысалы, IRX3, USP54, USP28 және DPYSL3) айтарлықтай айырмашылықтар байқалды (4C сурет). Транскриптомиялық және протеомикалық деректер жиынтықтары арасында дифференциалды түрде экспрессияланатын белгілердің айтарлықтай қабаттасуы байқалды (8B қосымша сурет), сондай-ақ негізінен саркомер белгілерінің айқын дифференциалды экспрессиясымен байланысты қатпарлы өзгеріс корреляциясы болды (8C қосымша сурет). Айта кету керек, кейбір сигнатуралар (мысалы, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) тек протеомдық деңгейде ғана транскрипциядан кейінгі күшті реттелуді көрсетті және баяу/жылдам талшықтың типіне тән экспрессиялық профильдерге ие болды (қосымша 8C сурет).
1G–H суреттеріндегі біркелкі көпжақты жуықтау және проекция (UMAP) графиктерімен анықталған баяу және жылдам кластерлерді салыстыратын A және B жанартау графиктері. Түрлі-түсті нүктелер FDR < 0,05 кезінде айтарлықтай ерекшеленетін транскрипттерді немесе ақуыздарды, ал күңгірт нүктелер логарифмдік өзгеріс > 1 кезінде айтарлықтай ерекшеленетін транскрипттерді немесе ақуыздарды білдіреді. Екі жақты статистикалық талдау Benjamini-Hochberg түзетілген p мәндері бар DESeq2 Wald сынағы (транскриптомика) немесе эмпирикалық Байес талдауы бар Лимма сызықтық моделі әдісімен, содан кейін бірнеше салыстырулар үшін Benjamini-Hochberg түзетуімен (протеомика) жүргізілді. C Баяу және жылдам талшықтар арасындағы таңдалған дифференциалды түрде экспрессияланған гендердің немесе ақуыздардың қолтаңбалық графиктері. D Айтарлықтай дифференциалды түрде экспрессияланған транскрипттер мен ақуыздарды байыту талдауы. Қабаттасатын мәндер екі деректер жиынтығында да байытылған, транскриптом мәндері тек транскриптомда, ал протеом мәндері тек протеомда байытылған. Статистикалық талдау Benjamini-Hochberg түзетілген p-мәндері бар clusterProfiler пакетін пайдаланып жүргізілді. E. SCENIC арқылы анықталған талшық түріне тән транскрипция факторлары, SCENIC-тен алынған реттегіштің ерекшелік ұпайлары және талшық түрлері арасындағы дифференциалды мРНҚ экспрессиясы негізінде. F. Баяу және жылдам талшықтар арасында дифференциалды түрде экспрессияланған таңдалған транскрипция факторларының профилін жасау.
Содан кейін біз дифференциалды түрде ұсынылған гендер мен ақуыздардың шамадан тыс көрсетілу талдауын жүргіздік (4D сурет, Қосымша деректер жиынтығы 13). Екі деректер жиынтығы арасында ерекшеленетін белгілердің жолын байыту күтілетін айырмашылықтарды анықтады, мысалы, май қышқылдарының β-тотығуы және кетон алмасу процестері (баяу талшықтар), миофиламент/бұлшықет жиырылуы (сәйкесінше жылдам және баяу талшықтар) және көмірсулардың катаболикалық процестері (жылдам талшықтар). Серин/треонин ақуыз фосфатазасының белсенділігі гликоген алмасуын реттейтіні белгілі реттеуші және каталитикалық фосфатаза суббірліктері (PPP3CB, PPP1R3D және PPP1R3A) сияқты белгілердің әсерінен жылдам талшықтарда да жоғарылады (47) (8D–E қосымша суреттері). Жылдам талшықтарға бай басқа жолдарға протеомдағы өңдеуші (P-) денелер (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (қосымша 8F сурет), транскрипциядан кейінгі реттеуге қатысуы мүмкін (48) және транскриптомдағы транскрипция факторының белсенділігі (SREBF1, RXRG, RORA) кірді (қосымша 8G сурет). Баяу талшықтар оксидоредуктаза белсенділігімен (BDH1, DCXR, TXN2) (қосымша 8H сурет), амидпен байланысумен (CPTP, PFDN2, CRYAB) (қосымша 8I сурет), жасушадан тыс матрицамен (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (қосымша 8J сурет) және рецептор-лиганд белсенділігімен (FNDC5, SPX, NENF) (қосымша 8K сурет) байытылған.
Баяу/жылдам бұлшықет талшығы типінің сипаттамаларының негізінде жатқан транскрипциялық реттеуді тереңірек түсіну үшін біз SCENIC49 (қосымша деректер жиынтығы 14) көмегімен транскрипция факторын байыту талдауын жүргіздік. Көптеген транскрипция факторлары жылдам және баяу бұлшықет талшықтары арасында айтарлықтай байытылған (4E сурет). Бұған бұрын бұлшықет талшығының жылдам дамуымен байланысты болған MAFA сияқты транскрипция факторлары,50 сондай-ақ бұрын бұлшықет талшығының типіне тән ген бағдарламаларымен байланысты емес бірнеше транскрипция факторлары кірді. Олардың ішінде PITX1, EGR1 және MYF6 жылдам бұлшықет талшықтарындағы ең байытылған транскрипция факторлары болды (4E сурет). Керісінше, ZSCAN30 және EPAS1 (HIF2A деп те аталады) баяу бұлшықет талшықтарындағы ең байытылған транскрипция факторлары болды (4E сурет). Осыған сәйкес, MAFA жылдам бұлшықет талшықтарына сәйкес келетін UMAP аймағында жоғары деңгейде экспрессияланды, ал EPAS1 керісінше экспрессия үлгісіне ие болды (4F сурет).
Белгілі ақуызды кодтайтын гендерден басқа, адамның дамуы мен ауруларын реттеуге қатысуы мүмкін көптеген кодталмайтын РНҚ биотиптері бар. 51, 52 Транскриптом деректер жиынтықтарында бірнеше кодталмайтын РНҚ талшық түріне тән ерекшелікті көрсетеді (5A сурет және қосымша деректер жиыны 15), соның ішінде баяу талшықтарға өте тән және митохондриялық миопатиясы бар науқастардың бұлшықеттерінде төмендегені туралы хабарланған LINC01405. 53 Керісінше, lnc-ERCC5-5 геніне сәйкес келетін RP11-255P5.3 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 жылдам талшық түріне тән ерекшелікті көрсетеді. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) және RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) екеуі де қаңқа бұлшықетінің ерекшелігін көрсетеді (9A–B қосымша суреттер) және олардың 1 Мб геномдық маңында белгілі жиырылу гендеріне ие емес, бұл олардың көршілес жиырылу гендерін реттеудің орнына талшық түрлерін реттеуде мамандандырылған рөл атқаратынын көрсетеді. LINC01405 және RP11-255P5.3 сәйкесінше баяу/жылдам талшық түріне тән экспрессия профильдері RNAscope көмегімен расталды (5B–C суреттер).
A. Кодталмайтын РНҚ транскрипттері баяу және тез жиырылатын бұлшықет талшықтарында айтарлықтай реттеледі. B. LINC01405 және RP11-255P5.3 талшықтарының баяу және тез жиырылатын түріне тәндігін көрсететін репрезентативті РНҚоскоп кескіндері. Масштаб жолағы = 50 мкм. C. РНҚоскоп арқылы анықталғандай, миофибраның түріне тән кодталмайтын РНҚ экспрессиясын сандық анықтау (тәуелсіз адамдардан алынған n = 3 биопсия, әр адамның ішіндегі жылдам және баяу бұлшықет талшықтарын салыстыру). Статистикалық талдау екі жақты Стьюденттің t-тестін қолдану арқылы жүргізілді. Қорап графиктерінде медиана және бірінші және үшінші квартильдер көрсетілген, мұрттылар минималды және максималды мәндерді көрсетеді. D. De novo микробтық ақуызды анықтау жұмыс процесі (BioRender.com арқылы жасалған). E. LINC01405_ORF408:17441:17358 микробтық ақуызы баяу қаңқа бұлшықет талшықтарында арнайы экспрессияланады (тәуелсіз қатысушылардан алынған n=5 биопсия, әр қатысушыдағы жылдам және баяу бұлшықет талшықтарын салыстыру). Статистикалық талдау Лимм сызықтық моделі әдісін эмпирикалық Байес тәсілімен біріктіріп, содан кейін p-мәнін түзетумен көптік салыстырулар үшін Бенджамини-Хохберг әдісін қолдана отырып жүргізілді. Қорап графиктерінде медиана, бірінші және үшінші квартильдер көрсетілген, мұрттылары максималды/минималды мәндерге бағытталған.
Жақында жүргізілген зерттеулер көптеген болжамды кодталмаған транскрипттер транскрипцияланған микробтық ақуыздарды кодтайтынын көрсетті, олардың кейбіреулері бұлшықет қызметін реттейді. 44, 55 Талшық түріне ерекшелігі бар микробтық ақуыздарды анықтау үшін біз 1000 талшықты транскриптом деректер жинағында табылған кодталмаған транскрипттер тізбегін (n = 305) қамтитын арнайы FASTA файлын пайдаланып, 1000 талшықты протеом деректер жиынтығын іздедік (5D сурет). Біз 22 түрлі транскрипттен 197 микробтық ақуызды анықтадық, олардың 71-і баяу және жылдам қаңқа бұлшықет талшықтары арасында дифференциалды түрде реттелді (9C қосымша сурет және 16 қосымша деректер жиынтығы). LINC01405 үшін үш микробтық ақуыз өнімі анықталды, олардың бірі транскриптіне ұқсас баяу талшыққа тән екенін көрсетті (5E сурет және 9D қосымша сурет). Осылайша, біз LINC01405-ті баяу қаңқа бұлшықет талшықтарына тән микробтық ақуызды кодтайтын ген ретінде анықтадық.
Біз жеке бұлшықет талшықтарының кең ауқымды протеомикалық сипаттамасы үшін кешенді жұмыс процесін әзірледік және сау күйлердегі талшықтардың гетерогенділігін реттегіштерді анықтадық. Біз бұл жұмыс процесін немалин миопатияларының қаңқа бұлшықет талшықтарының гетерогенділігіне қалай әсер ететінін түсіну үшін қолдандық. Немалин миопатиялары - бұлшықет әлсіздігін тудыратын және зардап шеккен балаларда тыныс алудың бұзылуы, сколиоз және аяқ-қолдардың қозғалғыштығының шектелуі сияқты бірқатар асқынулармен көрінетін тұқым қуалайтын бұлшықет аурулары. 19,20 Әдетте, немалин миопатияларында актин альфа 1 (ACTA1) сияқты гендердегі патогендік нұсқалар баяу жиырылатын талшық миофиберінің құрамының басым болуына әкеледі, дегенмен бұл әсер гетерогенді. Бір ерекшелік - жылдам талшықтардың басым болуына ие тропонин T1 немалин миопатия (TNNT1). Осылайша, немалин миопатияларында байқалатын қаңқа бұлшықет талшықтарының дисрегуляциясының негізінде жатқан гетерогенділікті жақсырақ түсіну бұл аурулар мен миофибер түрі арасындағы күрделі байланысты ашуға көмектеседі.
Сау бақылау тобымен салыстырғанда (топта n=3), ACTA1 және TNNT1 гендерінде мутациялары бар немалин миопатиясымен ауыратын науқастардан бөлінген миофабраларда миофабра атрофиясының немесе дистрофиясының айқын көрінісі байқалды (6A сурет, 3-қосымша кесте). Бұл қолжетімді материалдың шектеулі мөлшеріне байланысты протеомдық талдау үшін айтарлықтай техникалық қиындықтар туғызды. Осыған қарамастан, біз 272 қаңқа миофабраларында 2485 ақуызды анықтай алдық. Бір талшыққа кемінде 1000 сандық ақуыз сүзгіден өткізгеннен кейін, 250 талшық кейінгі биоинформатикалық талдауға ұшырады. Сүзгіден өткізгеннен кейін бір талшыққа орта есеппен 1573 ± 359 ақуыз сандық түрде анықталды (10A қосымша сурет, 17-18-қосымша деректер жиынтығы). Талшық мөлшерінің айтарлықтай азаюына қарамастан, немалин миопатиясымен ауыратын науқастар үлгілерінің протеом тереңдігі аздап азайды. Сонымен қатар, бұл деректерді өзіміздің FASTA файлдарымызды (кодталмаған транскрипттерді қоса алғанда) пайдаланып өңдеу бізге немалин миопатиясымен ауыратын науқастардың қаңқа миофатфаларында бес микробтық ақуызды анықтауға мүмкіндік берді (Қосымша деректер жиынтығы 19). Протеомның динамикалық диапазоны айтарлықтай кең болды, ал бақылау тобындағы жалпы ақуыздар алдыңғы 1000 талшықты протеом талдауының нәтижелерімен жақсы корреляцияланды (Қосымша 10B-C сурет).
A. ACTA1 және TNNT1 немалинді миопатияларында (NM) MYH негізінде талшық атрофиясын немесе дистрофиясын және әртүрлі талшық түрлерінің басым болуын көрсететін микроскопиялық суреттер. Масштаб жолағы = 100 мкм. ACTA1 және TNNT1 пациенттерінде бояудың қайталануын қамтамасыз ету үшін репрезентативті кескіндерді таңдамас бұрын үш пациенттің биопсиясы екі-үш рет (әр жағдайда төрт бөлім) боялды. B. MYH негізінде қатысушылардағы талшық түрінің пропорциялары. C. Немалинді миопатиялары бар және бақылау тобы бар пациенттердегі қаңқа бұлшықет талшықтарының негізгі компоненттік талдау (PCA) графигі. D. Немалинді миопатиялары бар және бақылау тобы бар пациенттердің қаңқа бұлшықет талшықтары 2-суретте талданған 1000 талшықтан анықталған PCA графигіне проекцияланған. Мысалы, ACTA1 және TNNT1 немалинді миопатиялары бар және бақылау тобы бар қатысушылар арасындағы айырмашылықтарды салыстыратын жанартау графиктері. Түрлі-түсті шеңберлер π < 0,05 кезінде айтарлықтай ерекшеленетін ақуыздарды, ал қара нүктелер FDR < 0,05 кезінде айтарлықтай ерекшеленетін ақуыздарды білдіреді. Статистикалық талдау Лимма сызықтық моделі әдісі және эмпирикалық Байес әдістері арқылы жүргізілді, содан кейін Бенджамини-Хохберг әдісін қолдана отырып, көптік салыстырулар үшін p-мәнін түзету жүргізілді. H. Бүкіл протеом бойынша және 1 және 2A типті талшықтардағы айтарлықтай дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздарды байыту талдауы. Статистикалық талдау clusterProfiler пакетін және Бенджамини-Хохберг түзетілген p-мәндерін қолдана отырып жүргізілді. I, J. Жасушадан тыс матрица және митохондриялық ген онтологиясы (GO) терминдерімен боялған негізгі компонентті талдау (PCA) графиктері.
Немалин миопатиялары қаңқа бұлшықетіндегі MYH экспрессиялайтын миофибра түрлерінің үлесіне әсер етуі мүмкін болғандықтан,19,20 біз алдымен немалин миопатиялары бар науқастар мен бақылау тобында MYH экспрессиялайтын миофибра түрлерін зерттедік. Біз миофибра түрін 1000 миофибра талдауы үшін бұрын сипатталған бейтарап әдісті қолдана отырып анықтадық (қосымша 10D-E суреттері) және тағы да таза 2X миофибраларды анықтай алмадық (6B сурет). Біз немалин миопатияларының миофибра түріне гетерогенді әсерін байқадық, себебі ACTA1 мутациясы бар екі науқаста 1 типті миофибралардың үлесі артты, ал TNNT1 немалин миопатиясы бар екі науқаста 1 типті миофибралардың үлесі төмендеді (6B сурет). Шынында да, MYH2 және жылдам тропонин изоформаларының (TNNC2, TNNI2 және TNNT3) экспрессиясы ACTA1-немалин миопатияларында төмендеді, ал MYH7 экспрессиясы TNNT1-немалин миопатияларында төмендеді (қосымша 11A сурет). Бұл немалин миопатияларында гетерогенді миофибра типінің ауысуы туралы бұрынғы есептерге сәйкес келеді.19,20 Біз бұл нәтижелерді иммуногистохимия арқылы растадық және ACTA1-немалин миопатиясы бар науқастарда 1 типті миофибралардың басым екенін, ал TNNT1-немалин миопатиясы бар науқастарда керісінше үлгі байқалғанын анықтадық (6A сурет).
Бір талшықты протеом деңгейінде ACTA1 және TNNT1 немалин миопатиясымен ауыратын науқастардың қаңқа бұлшықет талшықтары бақылау талшықтарының көпшілігімен топтастырылды, TNNT1 немалин миопатия талшықтары әдетте ең қатты зардап шекті (6C сурет). Бұл әсіресе әрбір науқас үшін жалған үрленген талшықтардың негізгі компоненттік талдау (PCA) графиктерін салу кезінде айқын көрінді, TNNT1 немалин миопатиясымен ауыратын 2 және 3 науқастар бақылау үлгілерінен ең алыс болып көрінді (қосымша 11B сурет, 20-қосымша деректер жиынтығы). Миопатиямен ауыратын науқастардың талшықтарының сау талшықтармен қалай салыстырылатынын жақсырақ түсіну үшін біз сау ересек қатысушылардың 1000 талшығының протеомикалық талдауынан алынған егжей-тегжейлі ақпаратты пайдаландық. Біз миопатия деректер жиынтығынан (ACTA1 және TNNT1 немалин миопатиясымен ауыратын науқастар және бақылау тобы) талшықтарды 1000 талшықты протеомикалық талдаудан алынған PCA графиктеріне проекцияладық (6D сурет). Бақылау талшықтарындағы PC2 бойымен MYH талшықтарының түрлерінің таралуы 1000 талшықты протеомдық талдаудан алынған талшықтардың таралуына ұқсас болды. Дегенмен, немалин миопатиясымен ауыратын науқастардағы талшықтардың көпшілігі PC2-ге төмен қарай ығысып, өздерінің табиғи MYH талшықтарының түріне қарамастан, сау тез жиырылатын талшықтармен қабаттасады. Осылайша, ACTA1 немалин миопатиясы бар науқастар MYH негізіндегі әдістерді қолдана отырып сандық бағалау кезінде 1 типті талшықтарға ауысқанын көрсеткенімен, ACTA1 немалин миопатиясы да, TNNT1 немалин миопатиясы да қаңқа бұлшықет талшығының протеомасын тез жиырылатын талшықтарға қарай ығыстырды.
Содан кейін біз әрбір пациент тобын сау бақылау тобымен тікелей салыстырдық және ACTA1 және TNNT1 немалин миопатияларында сәйкесінше 256 және 552 дифференциалды экспрессияланған ақуыздарды анықтадық (6E–G суреті және 11C қосымша суреті, 21 қосымша деректер жиынтығы). Гендерді байыту талдауы митохондриялық ақуыздардың үйлесімді төмендеуін көрсетті (6H–I суреті, 22 қосымша деректер жиынтығы). Таңқаларлығы, ACTA1 және TNNT1 немалин миопатияларында талшық түрлерінің дифференциалды басымдығына қарамастан, бұл төмендеу MYH негізіндегі талшық түріне толығымен тәуелсіз болды (6H суреті және 11D–I қосымша суреттері, 23 қосымша деректер жиынтығы). ACTA1 немесе TNNT1 немалин миопатияларында үш микробтық ақуыз да реттелді. Осы микропротеиндердің екеуі, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 немесе Lnc-FOXO1 деп те аталады) және ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), тек 1 типті миофибраларда ғана дифференциалды молшылық көрсетті. ENSG00000215483_TR14_ORF67 бұрын жасуша циклін реттеуде рөл атқаратыны туралы хабарланған. 56 Екінші жағынан, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 сәйкес келеді) ACTA1-немалин миопатиясында 1 типті және 2A типті миофибраларда сау бақылау тобымен салыстырғанда жоғарылаған (Қосымша 12A сурет, Қосымша деректер жиынтығы 24). Керісінше, рибосомалық ақуыздарға немалин миопатиясының әсері айтарлықтай болған жоқ, дегенмен RPS17 ACTA1 немалин миопатиясында төмендеген (6E сурет).
Байыту талдауы сонымен қатар ACTA1 және TNNT1 немалин миопатияларында иммундық жүйе процестерінің реттелуінің жоғарылауын анықтады, ал TNNT1 немалин миопатиясында жасуша адгезиясының да жоғарылауы байқалды (6H сурет). Бұл жасушадан тыс факторлардың байытылуы PC1 және PC2-дегі PCA-ны теріс бағытта (яғни, ең көп зардап шеккен талшықтарға қарай) жылжытатын жасушадан тыс матрица ақуыздарымен көрініс тапты (6J сурет). Пациенттердің екі тобында да иммундық жауаптарға және сарколеммалық қалпына келтіру механизмдеріне қатысатын жасушадан тыс ақуыздардың, мысалы, аннексиндердің (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 және олардың өзара әрекеттесетін ақуызы S100A1159 экспрессиясының жоғарылауы байқалды (12B–C қосымша суреттер). Бұл процесс бұрын бұлшықет дистрофияларында күшейетіні туралы хабарланған60, бірақ біздің білуімізше, бұрын немалин миопатияларымен байланысты болмаған. Бұл молекулалық механизмнің қалыпты жұмысы жарақаттан кейін сарколеммалық қалпына келтіру және жаңадан пайда болған миоциттердің миофибралармен бірігуі үшін қажет58,61. Осылайша, екі пациент тобында да бұл процестің белсенділігінің артуы миофибралардың тұрақсыздығынан туындаған жарақатқа репаративті реакцияны көрсетеді.
Әрбір немалин миопатиясының әсері жақсы корреляцияланған (r = 0,736) және сәйкесінше қабаттасуды көрсетті (11A–B қосымша суреттер), бұл ACTA1 және TNNT1 немалин миопатиясының протеомға ұқсас әсер ететінін көрсетеді. Дегенмен, кейбір ақуыздар тек ACTA1 немесе TNNT1 немалин миопатиясында ғана реттелді (11A және C қосымша суреттер). MFAP4 профибротикалық ақуызы TNNT1 немалин миопатиясындағы ең жоғары реттелетін ақуыздардың бірі болды, бірақ ACTA1 немалин миопатиясында өзгеріссіз қалды. HOX генінің транскрипциясын реттеуге жауапты PAF1C кешенінің компоненті SKIC8 TNNT1 немалин миопатиясында төмендеді, бірақ ACTA1 немалин миопатиясында әсер етпеді (11A қосымша сурет). ACTA1 және TNNT1 немалин миопатиясын тікелей салыстыру TNNT1 немалин миопатиясында митохондриялық ақуыздардың көбірек азаюын және иммундық жүйе ақуыздарының көбейгенін көрсетті (6G-H суреті және 11C және 11H-I қосымша суреттері). Бұл деректер TNNT1 немалин миопатиясында TNNT1 немалин миопатиясымен салыстырғанда байқалған атрофия/дистрофияның көбірек болуымен сәйкес келеді (6A суреті), бұл TNNT1 немалин миопатиясының аурудың ауыр түрін білдіретінін көрсетеді.
Немалин миопатиясының байқалған әсерлерінің бүкіл бұлшықет деңгейінде сақталатынын бағалау үшін біз TNNT1 немалин миопатиясымен ауыратын науқастардың сол когортасынан алынған бұлшықет биопсияларының көлемді протеомикалық талдауын жүргіздік және оларды бақылау тобымен (әр топ үшін n=3) салыстырдық (13A қосымша сурет, 25-қосымша деректер жиынтығы). Күтілгендей, бақылау тобы негізгі компонентті талдауда тығыз байланысты болды, ал TNNT1 немалин миопатиясымен ауыратын науқастар бір талшықты талдауда байқалғанға ұқсас жоғары үлгіаралық өзгергіштікті көрсетті (13B қосымша сурет). Көлемді талдау жеке талшықтарды салыстыру арқылы көрсетілген дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздарды (13C қосымша сурет, 26-қосымша деректер жиынтығы) және биологиялық процестерді (13D қосымша сурет, 27-қосымша деректер жиынтығы) қайталады, бірақ әртүрлі талшық түрлерін ажырату мүмкіндігін жоғалтты және талшықтар арасындағы гетерогенді аурудың әсерін ескере алмады.
Бұл деректер бірге алғанда, бір миофаблет протеомикасының иммуноблоттинг сияқты мақсатты әдістермен анықталмайтын клиникалық биологиялық ерекшеліктерді анықтай алатынын көрсетеді. Сонымен қатар, бұл деректер фенотиптік бейімделуді сипаттау үшін актин талшығының типтелуін (MYH) пайдаланудың шектеулерін көрсетеді. Шынында да, талшық түрін ауыстыру актин мен тропонин немалин миопатиялары арасында әртүрлі болғанымен, екі немалин миопатиясы да MYH талшығының типтелуін қаңқа бұлшықет талшығының метаболизмінен жылдамырақ және аз тотығу бұлшықет протеомына қарай ажыратады.
Жасушалық гетерогенділік тіндердің әртүрлі қажеттіліктерін қанағаттандыру үшін өте маңызды. Қаңқа бұлшықетінде бұл көбінесе күш өндіру мен шаршаудың әртүрлі дәрежелерімен сипатталатын талшық түрлері ретінде сипатталады. Дегенмен, бұл қаңқа бұлшықет талшығының өзгергіштігінің аз ғана бөлігін түсіндіретіні анық, ол бұрын ойлағаннан әлдеқайда өзгермелі, күрделі және көп қырлы. Технологиялық жетістіктер қазір қаңқа бұлшықет талшықтарын реттейтін факторларға жарық түсірді. Шынында да, біздің деректеріміз 2X типті талшықтар қаңқа бұлшықет талшығының бөлек кіші түрі болмауы мүмкін екенін көрсетеді. Сонымен қатар, біз метаболикалық ақуыздарды, рибосомалық ақуыздарды және жасушамен байланысты ақуыздарды қаңқа бұлшықет талшығының гетерогенділігінің негізгі детерминанттары ретінде анықтадық. Нематодты миопатиясы бар пациент үлгілеріне протеомикалық жұмыс процесін қолдану арқылы біз MYH негізіндегі талшық типтеуі қаңқа бұлшықетінің гетерогенділігін толық көрсетпейтінін, әсіресе жүйе бұзылған кезде екенін көрсеттік. Шынында да, MYH негізіндегі талшық түріне қарамастан, нематодты миопатия жылдамырақ және аз тотығу талшықтарына ауысуға әкеледі.
Қаңқа бұлшықет талшықтары 19 ғасырдан бері жіктеліп келеді. Жақында жүргізілген омикс талдаулары бізге әртүрлі MYH талшық түрлерінің экспрессия профильдерін және олардың әртүрлі тітіркендіргіштерге реакцияларын түсінуге мүмкіндік берді. Мұнда сипатталғандай, омикс тәсілдері қаңқа бұлшықет талшығының түрін анықтау үшін бір (немесе бірнеше) маркерді сандық анықтауға сүйенбестен, дәстүрлі антиденелерге негізделген әдістерге қарағанда талшық типінің маркерлерін сандық анықтауға жоғары сезімталдыққа ие. Біз қосымша транскриптомиялық және протеомикалық жұмыс процестерін қолдандық және нәтижелерді адам қаңқа бұлшықет талшықтарындағы талшықтың гетерогенділігінің транскрипциялық және транскрипциядан кейінгі реттелуін зерттеу үшін біріктірдік. Бұл жұмыс процесі біздің сау жас ерлердің когортасындағы vastus lateralis-тегі ақуыз деңгейінде таза 2X типті талшықтарды анықтау мүмкін болмады. Бұл сау vastus lateralis-те <1% таза 2X талшықтарын анықтаған бұрынғы бір талшықты зерттеулермен сәйкес келеді, дегенмен бұл болашақта басқа бұлшықеттерде расталуы керек. мРНҚ деңгейінде дерлік таза 2X талшықтарын анықтау мен ақуыз деңгейінде тек аралас 2A/2X талшықтары арасындағы сәйкессіздік таңқаларлық. MYH изоформасының мРНҚ экспрессиясы тәуліктік емес,67 бұл біздің РНҚ деңгейіндегі таза 2X талшықтарындағы MYH2 басталу сигналын «жіберіп алғанымыз» екіталай екенін көрсетеді. Бір мүмкін түсініктеме, таза гипотетикалық болса да, MYH изоформалары арасындағы ақуыз және/немесе мРНҚ тұрақтылығының айырмашылықтары болуы мүмкін. Шынында да, ешбір жылдам талшық кез келген MYH изоформасы үшін 100% таза емес және MYH1 мРНҚ экспрессия деңгейінің 70-90% диапазонында болуы ақуыз деңгейінде MYH1 және MYH2 мөлшеріне тең болатыны белгісіз. Дегенмен, бүкіл транскриптомды немесе протеомды қарастырған кезде, кластерлік талдау олардың нақты MYH құрамына қарамастан, баяу және жылдам қаңқа бұлшықет талшықтарын білдіретін тек екі бөлек кластерді сенімді түрде анықтай алады. Бұл әдетте тек екі бөлек мионуклеарлық кластерді анықтайтын бір ядролы транскриптомикалық тәсілдерді қолданатын талдауларға сәйкес келеді. 68, 69, 70 Сонымен қатар, бұрынғы протеомикалық зерттеулер 2X типті талшықтарды анықтағанымен, бұл талшықтар қалған жылдам талшықтардан бөлек топтаспайды және MYH негізіндегі басқа талшық түрлерімен салыстырғанда әртүрлі мол ақуыздардың аз ғана санын көрсетеді. 14 Бұл нәтижелер бізді 20 ғасырдың басындағы бұлшықет талшықтарының жіктелуіне қайта оралуымыз керек екенін көрсетеді, ол адамның қаңқа бұлшықет талшықтарын MYH негізінде үш бөлек класқа емес, метаболикалық және жиырылу қасиеттеріне негізделген екі кластерге бөлді. 63
Ең бастысы, миофибралардың гетерогенділігін бірнеше өлшем бойынша қарастыру керек. Бұрынғы «омика» зерттеулері осы бағытты көрсетті, бұл қаңқа бұлшықет талшықтарының дискретті кластерлер құрмайтынын, бірақ континуум бойымен орналасқанын көрсетеді. 11, 13, 14, 64, 71 Мұнда біз қаңқа бұлшықетінің жиырылу және метаболикалық қасиеттеріндегі айырмашылықтардан басқа, миофибраларды жасуша-жасуша өзара әрекеттесуі мен трансляция механизмдеріне байланысты ерекшеліктер арқылы ажыратуға болатынын көрсетеміз. Шынында да, біз қаңқа бұлшықет талшықтарындағы рибосомалардың гетерогенділігін баяу және жылдам талшық түрлеріне тәуелсіз гетерогенділікке ықпал ететінін анықтадық. Баяу және жылдам талшық түріне тәуелсіз бұл айтарлықтай миофибралардың гетерогенділігінің негізгі себебі әлі күнге дейін түсініксіз, бірақ ол белгілі бір күштер мен жүктемелерге оңтайлы жауап беретін бұлшықет шоғырларында мамандандырылған кеңістіктік ұйымдасуды,72 бұлшықет микроортасында басқа жасуша түрлерімен мамандандырылған жасушалық немесе органға тән байланысты73,74,75 немесе жеке миофибралардың ішіндегі рибосома белсенділігінің айырмашылықтарын көрсетуі мүмкін. Шынында да, рибосомалық гетероплазмия, RPL3 және RPL3L паралогиялық алмастыруы арқылы немесе рРНҚ-ның 2′O-метилденуі деңгейінде, қаңқа бұлшықетінің гипертрофиясымен байланысты екені көрсетілген76,77. Жеке миофибралардың функционалдық сипаттамасымен біріктірілген мультиомик және кеңістіктік қолдану бұлшықет биологиясын мультиомик деңгейде түсінуімізді одан әрі дамытады78.
Немалин миопатиялары бар науқастардың жеке миофабраларының протеомдарын талдау арқылы біз қаңқа бұлшықеттерінің клиникалық патофизиологиясын түсіндіру үшін жеке миофабра протеомикасының пайдалылығын, тиімділігін және қолданылуын көрсеттік. Сонымен қатар, жұмыс процесімізді жаһандық протеомикалық талдаумен салыстыра отырып, біз жеке миофабра протеомикасының жаһандық тін протеомикасымен бірдей ақпарат тереңдігін беретінін және бұл тереңдікті талшықтар аралық гетерогенділік пен миофабра түрін ескеру арқылы кеңейтетінін көрсете алдық. ACTA1 және TNNT1 немалин миопатияларында сау бақылау тобымен салыстырғанда талшық түрі қатынасындағы күтілетін (айнымалы болса да) айырмашылықтардан басқа,19 біз MYH арқылы талшық түрін ауыстырудан тәуелсіз тотығу және жасушадан тыс қайта құруды да байқадық. Фиброз бұрын TNNT1 немалин миопатияларында тіркелген болатын.19 Дегенмен, біздің талдауымыз ACTA1 және TNNT1 немалин миопатиялары бар науқастардың миофибраларында сарколеммалық қалпына келтіру механизмдеріне қатысатын аннексиндер сияқты жасушадан тыс бөлінетін стресске байланысты ақуыздардың деңгейінің жоғарылауын анықтау арқылы осы тұжырымға негізделген.57,58,59 Қорытындылай келе, немалин миопатиясымен ауыратын науқастардың миофибраларында аннексин деңгейінің жоғарылауы ауыр атрофиялық миофибраларды қалпына келтіруге жасушалық реакцияны білдіруі мүмкін.
Бұл зерттеу бүгінгі күнге дейін адамдардың бір талшықты тұтас бұлшықет-омикасын талдаудың ең үлкен нұсқасы болғанымен, ол шектеусіз емес. Біз қатысушылардың салыстырмалы түрде шағын және біртекті үлгісінен және бір бұлшықеттен (vastus lateralis) қаңқа бұлшықет талшықтарын бөліп алдық. Сондықтан, бұлшықет түрлерінде және бұлшықет физиологиясының шеткі кезеңдерінде белгілі бір талшық популяцияларының болуын жоққа шығару мүмкін емес. Мысалы, жоғары білікті спринтерлерде және/немесе күш спортшыларында79 немесе бұлшықет белсенділігінің болмауы кезеңдерінде66,80 ультра жылдам талшықтардың (мысалы, таза 2X талшықтарының) пайда болу мүмкіндігін жоққа шығара алмаймыз. Сонымен қатар, қатысушылардың шектеулі үлгі мөлшері бізге талшықтардың гетерогенділігіндегі жыныстық айырмашылықтарды зерттеуге кедергі келтірді, себебі талшық түрлерінің арақатынасы ерлер мен әйелдер арасында әртүрлі екені белгілі. Сонымен қатар, біз бірдей бұлшықет талшықтарында немесе бірдей қатысушылардың үлгілерінде транскриптомдық және протеомикалық талдаулар жүргізе алмадық. Біз және басқалар омикалық талдауды қолдана отырып, бір жасушалы және бір миофибра талдауын оңтайландыруды жалғастырған сайын, өте төмен үлгі кірісіне қол жеткізу үшін (митохондриялық миопатиясы бар науқастардан алынған талшықтарды талдауда көрсетілгендей), бір бұлшықет талшықтарында мультиомик (және функционалды) тәсілдерді біріктіру мүмкіндігі айқындала түседі.
Жалпы алғанда, біздің деректеріміз қаңқа бұлшықеттерінің гетерогенділігінің транскрипциялық және транскрипциядан кейінгі қозғаушы күштерін анықтайды және түсіндіреді. Нақтырақ айтқанда, біз талшық түрлерінің классикалық MYH негізіндегі анықтамасымен байланысты қаңқа бұлшықеттерінің физиологиясындағы ұзақ уақыт бойы қалыптасқан догмаға қарсы шығатын деректерді ұсынамыз. Біз пікірталасты жаңартып, сайып келгенде қаңқа бұлшықет талшықтарының жіктелуі мен гетерогенділігі туралы түсінігімізді қайта қарастырамыз деп үміттенеміз.
Он төрт ақ нәсілді қатысушы (12 ер адам және 2 әйел) осы зерттеуге қатысуға ерікті түрде келісті. Зерттеу Гент университетінің ауруханасының (BC-10237) этика комитетімен мақұлданды, 2013 жылғы Хельсинки декларациясына сәйкес келді және ClinicalTrials.gov (NCT05131555) сайтында тіркелді. Қатысушылардың жалпы сипаттамалары 1-қосымша кестеде келтірілген. Ауызша және жазбаша түрде хабардар етілген келісім алғаннан кейін, қатысушылар зерттеуге соңғы рет енгізілмес бұрын медициналық тексеруден өтті. Қатысушылар жас (22-42 жас), дені сау (медициналық жағдайлары жоқ, темекі шегу тарихы жоқ) және орташа физикалық белсенді болды. Оттегінің максималды сіңуі бұрын сипатталғандай физикалық дайындықты бағалау үшін қадамдық эргометрді пайдаланып анықталды. 81
Бұлшықет биопсиясының үлгілері тыныштықта және аш қарынға үш рет, 14 күн аралықпен жиналды. Бұл үлгілер үлкен зерттеудің бөлігі ретінде жиналғандықтан, қатысушылар биопсиядан 40 минут бұрын плацебо (лактоза), H1-рецепторларының антагонисін (540 мг фексофенадин) немесе H2-рецепторларының антагонисін (40 мг фамотидин) тұтынды. Біз бұған дейін бұл гистаминдік рецепторлардың антагонистері тыныштықтағы қаңқа бұлшықеттерінің фитнесіне әсер етпейтінін көрсеттік81 және біздің сапаны бақылау кестелерімізде ешқандай жағдайға байланысты кластерлеу байқалмады (3 және 6 қосымша суреттер). Әрбір тәжірибе күнінен 48 сағат бұрын стандартталған диета (дене салмағына 41,4 ккал/кг, дене салмағына 5,1 г/кг көмірсу, дене салмағына 1,4 г/кг ақуыз және дене салмағына 1,6 г/кг май) сақталды, ал тәжірибе күні таңертең стандартталған таңғы ас (дене салмағына 1,5 г/кг көмірсу) тұтынды. Жергілікті анестезия кезінде (адреналинсіз 0,5 мл 1% лидокаин), бұлшықет биопсиялары тері арқылы Бергстрём аспирациясын қолдану арқылы vastus lateralis бұлшықетінен алынды.82 Бұлшықет үлгілері дереу РНҚ-ға енгізіліп, талшықтарды қолмен бөлгенге дейін (3 күнге дейін) 4°C температурада сақталды.
Жаңадан бөлінген миофибер шоғырлары өсіру ыдысындағы жаңа РНҚ-латер ортасына ауыстырылды. Содан кейін жеке миофиберлер стереомикроскоп пен жіңішке пинцет көмегімен қолмен бөлінді. Әрбір биопсиядан жиырма бес талшық бөлінді, биопсияның әртүрлі аймақтарынан талшықтарды таңдауға ерекше назар аударылды. Бөлінгеннен кейін, әрбір талшық қажет емес ақуыздар мен ДНҚ-ны кетіру үшін протеиназа К және ДНҚ ферменттері бар 3 мкл лизис буферіне (SingleShot Cell Lisis Kit, Bio-Rad) ақырын батырылды. Содан кейін жасуша лизисі және ақуыз/ДНҚ-ны бөліп алу қысқа мерзімді араластыру, сұйықтықты микроцентрифугада айналдыру және бөлме температурасында (10 мин) инкубациялау арқылы басталды. Содан кейін лизат термиялық циклерде (T100, Bio-Rad) 37°C температурада 5 минут, 75°C температурада 5 минут инкубацияланды, содан кейін одан әрі өңдеуге дейін бірден -80°C температурада сақталды.
Illumina-үйлесімді полиаденилденген РНҚ кітапханалары 2 мкл миофибер лизатынан QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq кітапханасын дайындау жинағын (Lexogen) пайдаланып дайындалды. Толық әдістерді өндірушінің нұсқаулығынан табуға болады. Процесс кері транскрипция арқылы бірінші тізбекті кДНҚ синтезінен басталады, оның барысында үлгілерді біріктіруді қамтамасыз ету және кейінгі өңдеу кезінде техникалық өзгергіштікті азайту үшін бірегей молекулалық идентификаторлар (UMI) және үлгіге тән i1 штрих-кодтары енгізіледі. Содан кейін 96 миофиберден алынған кДНҚ біріктіріліп, магниттік моншақтармен тазартылады, содан кейін РНҚ алынып тасталады және кездейсоқ праймерлерді пайдаланып екінші тізбекті синтездеу жүргізіледі. Кітапхана магниттік моншақтармен тазартылады, пулға тән i5/i7 тегтері қосылады және ПТР күшейтіледі. Соңғы тазарту қадамы Illumina-үйлесімді кітапханаларды шығарады. Әрбір кітапхана пулының сапасы жоғары сезімталдықтағы шағын фрагменттік ДНҚ талдау жинағын (Agilent Technologies, DNF-477-0500) пайдаланып бағаланды.
Qubit сандық бағалауына сүйене отырып, пулдар эквимолярлық концентрацияларда (2 нМ) одан әрі біріктірілді. Содан кейін алынған пул NovaSeq 6000 құралында стандартты режимде 2 нМ жүктемемен (4% PhiX) NovaSeq S2 реагент жинағын (1 × 100 нуклеотид) пайдаланып секвенирленді.
Біздің құбырымыз Lexogen компаниясының QuantSeq Pool деректер талдау құбырына негізделген (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Деректер алдымен i7/i5 индексіне негізделген bcl2fastq2 (v2.20.0) көмегімен демультиплекстелді. Содан кейін 2-оқу i1 үлгісінің штрих-кодына негізделген idemux (v0.1.6) көмегімен демультиплекстелді және UMI тізбектері umi_tools (v1.0.1) көмегімен алынды. Содан кейін оқулар қысқа оқуларды (<20 ұзындықтағы) немесе тек адаптер тізбектерінен тұратын оқуларды алып тастау үшін бірнеше айналымда cutadapt (v3.4) көмегімен кесілді. Содан кейін оқулар STAR (v2.6.0c) көмегімен адам геномына тураланды және BAM файлдары SAMtools (v1.11) көмегімен индекстелді. Қайталанатын оқулар umi_tools (v1.0.1) көмегімен жойылды. Соңында, туралауды санау Subread (v2.0.3) ішіндегі featureCounts көмегімен орындалды. Сапаны бақылау құбырдың бірнеше аралық кезеңдерінде FastQC (v0.11.9) көмегімен жүргізілді.
Барлық биоинформатика өңдеу және визуализациялау жұмыстары R (v4.2.3) тілінде, негізінен Seurat (v4.4.0) жұмыс процесін пайдаланып жүргізілді. 83 Сондықтан, жеке UMI мәндері мен метадеректер матрицалары Seurat нысандарына түрлендірілді. Барлық талшықтардың 30%-дан азында көрсетілген гендер алынып тасталды. Төмен сапалы үлгілер 1000 UMI мәндері мен 1000 анықталған геннің ең төменгі шегі негізінде алынып тасталды. Сайып келгенде, 925 талшық барлық сапаны бақылау сүзгілеу кезеңдерінен өтті. UMI мәндері Seurat SCTransform v2 әдісін қолдана отырып қалыпқа келтірілді, 84 анықталған барлық 7418 ерекшелікті қоса алғанда, қатысушылар арасындағы айырмашылықтар кері қайтарылды. Барлық тиісті метадеректерді 28-қосымша деректер жиынтығынан табуға болады.
Жарияланған уақыты: 2025 жылғы 10 қыркүйек