Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет. Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар. Ең жақсы нәтижелерге қол жеткізу үшін жаңарақ шолғышты пайдалану ұсынылады (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіру). Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Модикалық өзгерістердің жануарлар үлгілерін (МК) құру МК-ны зерттеу үшін маңызды негіз болып табылады. Елу төрт Жаңа Зеландиялық ақ қояндар жасанды операция тобына, бұлшықет имплантациясы тобына (ME тобы) және ядро пульпозды имплантация тобына (NPE тобы) бөлінді. NPE тобында омыртқа аралық дискі антеротеральды белдік хирургиялық тәсілмен ашылды және соңғы пластинкаға жақын L5 омыртқа денесін тесу үшін ине қолданылды. NP шприц арқылы L1/2 омыртқааралық дискіден шығарылып, оған енгізілді. Субхондральды сүйекте тесікті бұрғылау. Бұлшықет имплантациясы тобындағы және жасанды операция тобындағы хирургиялық процедуралар мен бұрғылау әдістері NP имплантация тобындағылармен бірдей болды. ME тобында бұлшық ет бөлігі тесікке орналастырылған, ал жалған операция тобында тесікке ештеңе салынбаған. Операциядан кейін МРТ сканерлеу және молекулалық биологиялық тестілеу жүргізілді. NPE тобындағы сигнал өзгерді, бірақ жалған операция тобында және ME тобында айқын сигнал өзгерісі болмады. Гистологиялық бақылау имплантация орнында аномальды тіндердің пролиферациясының байқалғанын және NPE тобында IL-4, IL-17 және IFN-γ экспрессиясының жоғарылағанын көрсетті. Субхондральды сүйекке NP имплантациясы МК-ның жануар үлгісін құра алады.
Модикалық өзгерістер (MC) - магнитті-резонансты бейнелеуде (МРТ) көрінетін омыртқалардың соңғы пластиналары мен іргелес сүйек кемігінің зақымдануы. Олар ілеспе белгілері бар адамдарда жиі кездеседі1. Көптеген зерттеулер төменгі арқа ауруы (LBP) 2,3 байланысына байланысты MC маңыздылығын атап өтті. de Roos et al.4 және Modic et al.5 алдымен омыртқа сүйек кемігіндегі субхондральды сигнал ауытқуларының үш түрлі түрін дербес сипаттады. I түрдегі модикалық өзгерістер T1-салмақталған (T1W) тізбектерде гипоинтенсті және T2-салмақталған (T2W) тізбегінде гиперинтенсті. Бұл зақымдануда сүйек кемігіндегі фиссураның соңғы пластиналары мен іргелес тамырлы түйіршіктеу тіндері анықталады. Модикалық түрдегі II өзгерістер T1W және T2W тізбектерінде жоғары сигналды көрсетеді. Зақымданудың бұл түрінде соңғы пластинаның деструкциясы, сонымен қатар іргелес сүйек кемігінің гистологиялық майлы алмастырылуын табуға болады. Модикалық түрдегі III өзгерістер T1W және T2W тізбектерінде төмен сигналды көрсетеді. Соңғы пластинкаларға сәйкес келетін склеротикалық зақымданулар байқалды6. МК омыртқаның патологиялық ауруы болып саналады және омыртқаның көптеген дегенеративті ауруларымен тығыз байланысты7,8,9.
Қолда бар деректерді ескере отырып, бірнеше зерттеулер МК этиологиясы мен патологиялық механизмдері туралы егжей-тегжейлі түсінік берді. Альберт және т.б. MC диск грыжасынан туындауы мүмкін деген болжам жасады8. Ху және т.б. MC дискінің ауыр дегенерациясына жатқызылды10. Крок «ішкі дискінің жарылуы» концепциясын ұсынды, онда қайталанатын диск жарақаты соңғы пластинаның микрокөзге түсуіне әкелуі мүмкін. Жарық пайда болғаннан кейін пульпоздық ядроның (NP) соңғы пластинкасының бұзылуы аутоиммундық жауапты тудыруы мүмкін, бұл одан әрі MC11 дамуына әкеледі. Ма және т.б. ұқсас көзқараспен бөлісті және NP-индукцияланған аутоиммунитет MC12 патогенезінде негізгі рөл атқаратынын хабарлады.
Иммундық жүйе жасушалары, әсіресе CD4+ Т көмекші лимфоциттері аутоиммунитет патогенезінде маңызды рөл атқарады13. Жақында ашылған Th17 ішкі жиыны IL-17 қабынуға қарсы цитокинді шығарады, химокиннің экспрессиясына ықпал етеді және зақымдалған органдардағы Т жасушаларын IFN-γ14 өндіру үшін ынталандырады. Th2 жасушалары иммундық жауаптардың патогенезінде де ерекше рөл атқарады. IL-4 өкілі Th2 жасушасы ретінде экспрессиясы ауыр иммунопатологиялық салдарға әкелуі мүмкін15.
MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 бойынша көптеген клиникалық зерттеулер жүргізілгенімен, адамдарда жиі болатын MC процесін еліктей алатын қолайлы жануарлардың тәжірибелік үлгілері әлі де жетіспейді. этиологияны немесе мақсатты терапия сияқты жаңа емдеу әдістерін зерттеу үшін қолданылады. Бүгінгі күні негізгі патологиялық механизмдерді зерттеу үшін МК-ның бірнеше жануарлар үлгілері ғана хабарланды.
Альберт пен Ма ұсынған аутоиммундық теорияға сүйене отырып, бұл зерттеу бұрғыланған омыртқа пластинасының жанында NP автотрансплантациялау арқылы қарапайым және қайталанатын қоян MC үлгісін құрды. Басқа мақсаттар жануарлар үлгілерінің гистологиялық сипаттамаларын байқау және МК дамуындағы НП-ның нақты механизмдерін бағалау болып табылады. Осы мақсатта біз MC прогрессиясын зерттеу үшін молекулалық биология, МРТ және гистологиялық зерттеулер сияқты әдістерді қолданамыз.
Екі қоян операция кезінде қан кетуден, ал төрт қоян МРТ кезінде наркоз кезінде өлді. Қалған 48 қоян аман қалды және операциядан кейін мінез-құлық немесе неврологиялық белгілер байқалмады.
МРТ әртүрлі саңылаулардағы енгізілген тіндердің сигнал қарқындылығы әртүрлі екенін көрсетеді. NPE тобындағы L5 омыртқа денесінің сигнал қарқындылығы кірістіруден кейін 12, 16 және 20 аптада біртіндеп өзгерді (T1W тізбегі төмен сигналды көрсетті, ал T2W тізбегі аралас сигнал плюс төмен сигналды көрсетті) (1С-сурет), МРТ пайда болды басқа екі топтың кірістірілген бөлшектері сол кезеңде салыстырмалы түрде тұрақты болып қалды (сурет 1А, В).
(A) 3 уақыт нүктесінде қоянның бел омыртқасының репрезентативті дәйекті МРТ. Жалған операция тобының суреттерінде сигналдық ауытқулар табылмады. (B) ME тобындағы омыртқа денесінің сигналдық сипаттамалары жалған операция тобындағыларға ұқсас және уақыт өте келе кірістіру орнында маңызды сигнал өзгерісі байқалмайды. (C) NPE тобында төмен сигнал T1W тізбегінде анық көрінеді, ал аралас сигнал және төмен сигнал T2W тізбегінде анық көрінеді. 12-апталық кезеңнен 20-апталық кезеңге дейін, T2W тізбегіндегі төмен сигналдарды қоршап тұрған спорадикалық жоғары сигналдар азаяды.
НПЭ тобында омыртқа денесін имплантациялау орнында айқын сүйек гиперплазиясын көруге болады, ал сүйек гиперплазиясы 12-20 аптаға дейін тезірек жүреді (2С-сурет) NPE тобымен салыстырғанда, модельденген омыртқада айтарлықтай өзгеріс байқалмайды. органдар; Шам тобы және ME тобы (2С-сурет) 2А,Б).
А) Имплантацияланған бөліктегі омыртқа денесінің беті өте тегіс, тесігі жақсы жазылады, омыртқа денесінде гиперплазия жоқ. (B) ME тобындағы имплантацияланған жердің пішіні жасанды операция тобындағыға ұқсас және уақыт өте келе имплантацияланған жердің сыртқы көрінісінде айқын өзгеріс болмайды. (C) NPE тобында имплантацияланған жерде сүйек гиперплазиясы пайда болды. Сүйек гиперплазиясы тез өсті және тіпті омыртқааралық диск арқылы қарама-қарсы омыртқа денесіне дейін созылды.
Гистологиялық талдау сүйек түзілуі туралы толығырақ ақпарат береді. 3-суретте H&E-мен боялған операциядан кейінгі секциялардың фотосуреттері көрсетілген. Жалған операция тобында хондроциттер жақсы орналасып, жасуша пролиферациясы анықталмады (3А-сурет). ME тобындағы жағдай жалған операция тобындағы жағдайға ұқсас болды (3В-сурет). Дегенмен, NPE тобында имплантация орнында хондроциттердің көп саны және NP тәрізді жасушалардың пролиферациясы байқалды (3С-сурет);
(A) Трабекулалар шеткі пластинкаға жақын жерде көрінеді, хондроциттер біркелкі жасуша өлшемі мен пішінімен ұқыпты орналасқан және пролиферациясыз (40 рет). (B) ME тобындағы имплантация орнының жағдайы жасанды топтағы жағдайға ұқсас. Трабекулалар мен хондроциттер көрінеді, бірақ имплантация орнында айқын пролиферация болмайды (40 рет). B) Хондроциттер мен NP-тәрізді жасушалар айтарлықтай көбейетінін, хондроциттердің пішіні мен өлшемдерінің біркелкі емес (40 есе) болатынын көруге болады.
Интерлейкин 4 (IL-4) мРНҚ, интерлейкин 17 (ИЛ-17) мРНҚ және интерферон γ (IFN-γ) мРНҚ экспрессиясы NPE және ME топтарында байқалды. Мақсатты гендердің экспрессиялық деңгейлері салыстырылған кезде, IL-4, IL-17 және IFN-γ гендерінің экспрессиялары ME тобы мен жалған операция тобымен салыстырғанда NPE тобында айтарлықтай жоғарылады (4-сурет). (P <0,05). Жалған операция тобымен салыстырғанда, ME тобында IL-4, IL-17 және IFN-γ экспрессия деңгейлері шамалы ғана өсті және статистикалық өзгеріске жеткен жоқ (P > 0,05).
NPE тобындағы IL-4, IL-17 және IFN-γ mRNA экспрессиясы жалған операция тобындағы және ME тобына қарағанда айтарлықтай жоғары тенденцияны көрсетті (P <0,05).
Керісінше, ME тобындағы өрнек деңгейлері айтарлықтай айырмашылықты көрсетпеді (P>0,05).
Western blot талдауы өзгертілген мРНҚ экспрессия үлгісін растау үшін IL-4 және IL-17-ге қарсы коммерциялық қолжетімді антиденелерді пайдалану арқылы орындалды. 5A,B суреттерінде көрсетілгендей, ME тобымен және жалған операция тобымен салыстырғанда, NPE тобындағы IL-4 және IL-17 ақуыз деңгейлері айтарлықтай жоғарылады (P <0,05). Жалған операция тобымен салыстырғанда, ME тобындағы IL-4 және IL-17 ақуыз деңгейлері де статистикалық маңызды өзгерістерге жете алмады (P> 0,05).
(A) NPE тобындағы IL-4 және IL-17 ақуыз деңгейлері ME тобына және плацебо тобындағыларға қарағанда айтарлықтай жоғары болды (P <0,05). (B) Western blot гистограммасы.
Операция кезінде алынған адам үлгілерінің шектеулі санына байланысты МК патогенезі бойынша нақты және егжей-тегжейлі зерттеулер біршама қиын. Біз оның потенциалды патологиялық механизмдерін зерттеу үшін МК жануарларының үлгісін құруға тырыстық. Бұл ретте радиологиялық бағалау, гистологиялық бағалау және молекулалық биологиялық бағалау NP аутотрансплантатымен индукцияланған МК курсын бақылау үшін пайдаланылды. Нәтижесінде, NP имплантация моделі тіндердің өзгерістерін және гистологиялық және молекулалық өзгерістерді көрсететін сигнал қарқындылығының 12-аптадан 20-апталық уақыт нүктелеріне (T1W тізбектеріндегі аралас төмен сигнал және T2W тізбектеріндегі төмен сигнал) біртіндеп өзгеруіне әкелді. биологиялық бағалаулар радиологиялық зерттеу нәтижелерін растады.
Бұл тәжірибенің нәтижелері көрсеткендей, визуалды және гистологиялық өзгерістер NPE тобындағы омыртқалы дененің бұзылу орнында болған. Бұл ретте IL-4, IL-17 және IFN-γ гендерінің, сондай-ақ IL-4, IL-17 және IFN-γ экспрессиясы байқалды, бұл омыртқадағы пульпозды тіннің аутологиялық ядросының бұзылуын көрсетеді. дене бірқатар сигналдық және морфологиялық өзгерістерді тудыруы мүмкін. Жануарлар үлгісінің омыртқа денелерінің сигналдық сипаттамалары (T1W тізбегіндегі төмен сигнал, аралас сигнал және T2W тізбегіндегі төмен сигнал) адамның омыртқа жасушаларына өте ұқсас екенін табу оңай, сонымен қатар МРТ сипаттамалары. гистология және жалпы анатомия бақылауларын растау, яғни омыртқа денесінің жасушаларындағы өзгерістер прогрессивті. Жедел жарақаттан туындаған қабыну реакциясы пункциядан кейін көп ұзамай пайда болуы мүмкін болса да, МРТ нәтижелері бірте-бірте ұлғайған сигнал өзгерістерінің пункциядан кейін 12 аптадан кейін пайда болғанын және МРТ өзгерістерінің қалпына келу немесе кері қайтару белгілерінсіз 20 аптаға дейін сақталатынын көрсетті. Бұл нәтижелер аутологиялық омыртқалы NP қояндарда прогрессивті MV анықтаудың сенімді әдісі екенін көрсетеді.
Бұл пункция үлгісі тиісті шеберлікті, уақытты және хирургиялық күш-жігерді қажет етеді. Алдын ала жүргізілген тәжірибелерде паравертебральды байлам құрылымдарын бөлу немесе шамадан тыс ынталандыру омыртқа остеофиттерінің пайда болуына әкелуі мүмкін. Көрші дискілерді зақымдамау немесе тітіркендірмеу үшін абай болу керек. Тұрақты және қайталанатын нәтижелерді алу үшін ену тереңдігін бақылау керек болғандықтан, біз ұзындығы 3 мм иненің қабығын кесу арқылы қолмен тығын жасадық. Бұл тығынды пайдалану омыртқа денесінде біркелкі бұрғылау тереңдігін қамтамасыз етеді. Алдын ала жүргізілген эксперименттерде операцияға қатысқан үш ортопед хирург 16-габаритті инелерді 18-габаритті инелермен немесе басқа әдістермен жұмыс істеуге оңайырақ деп тапты. Бұрғылау кезінде шамадан тыс қан кетуді болдырмау үшін инені біраз уақыт қозғалтпай ұстау ыңғайлырақ енгізу саңылауын қамтамасыз етеді, бұл МК-ның белгілі бір дәрежесін осылай басқаруға болатынын көрсетеді.
Көптеген зерттеулер MC-ге бағытталған болса да, MC25,26,27 этиологиясы мен патогенезі туралы аз біледі. Алдыңғы зерттеулерімізге сүйене отырып, біз аутоиммундық MC12 пайда болуы мен дамуында маңызды рөл атқаратынын анықтадық. Бұл зерттеу антиген стимуляциясынан кейін CD4+ жасушаларының негізгі дифференциация жолдары болып табылатын IL-4, IL-17 және IFN-γ сандық экспрессиясын зерттеді. Біздің зерттеуімізде теріс топпен салыстырғанда, NPE тобында IL-4, IL-17 және IFN-γ жоғары экспрессия болды, ал IL-4 және IL-17 ақуыз деңгейлері де жоғары болды.
Клиникалық түрде IL-17 мРНҚ экспрессиясы диск грыжасы бар науқастардың NP жасушаларында жоғарылайды28. IL-4 және IFN-γ экспрессия деңгейлерінің жоғарылауы сау бақылаулармен салыстырғанда жедел қысылмайтын диск грыжа үлгісінде де табылды29. IL-17 қабынуда, аутоиммунды ауруларда тіндердің зақымдалуында негізгі рөл атқарады30 және IFN-γ31-ге иммундық жауапты күшейтеді. MRL/lpr тышқандарында32 және аутоиммунитетке сезімтал тышқандарда33 IL-17-делдалдық тіннің зақымдануының күшеюі туралы хабарланды. IL-4 қабынуға қарсы цитокиндердің (мысалы, IL-1β және TNFα) экспрессиясын және макрофагтардың белсендірілуін тежей алады34. IL-4 мРНҚ экспрессиясы NPE тобында бір уақытта IL-17 және IFN-γ-мен салыстырғанда әртүрлі болғаны хабарланды; NPE тобындағы IFN-γ mRNA экспрессиясы басқа топтарға қарағанда айтарлықтай жоғары болды. Сондықтан IFN-γ өндірісі NP интеркалациясынан туындаған қабыну реакциясының медиаторы болуы мүмкін. Зерттеулер IFN-γ белсендірілген 1 типті көмекші Т-клеткаларды, табиғи өлтіруші жасушаларды және макрофагтарды35,36 қоса алғанда, көптеген жасуша түрлерімен өндірілетінін көрсетті және иммундық жауаптарды ынталандыратын негізгі қабынуға қарсы цитокин болып табылады37.
Бұл зерттеу аутоиммундық жауаптың МК пайда болуына және дамуына қатысуы мүмкін екенін көрсетеді. Луома және т.б. MC және көрнекті NP сигналдық сипаттамалары МРТ-де ұқсас екенін және екеуі де T2W тізбегінде жоғары сигналды көрсететінін анықтады38. Кейбір цитокиндердің IL-139 сияқты МК пайда болуымен тығыз байланысты екендігі расталды. Ма және т.б. NP жоғары немесе төмен шығуы MC12 пайда болуына және дамуына үлкен әсер етуі мүмкін деп болжады. Bobechko40 және Herzbein et al.41 NP иммунотолерантты тін болып табылады, ол туылғаннан бастап тамырлы қан айналымына кіре алмайды. NP шығыңқы жерлері бөтен денелерді қанмен қамтамасыз етеді, осылайша жергілікті аутоиммундық реакцияларға делдал болады42. Аутоиммундық реакциялар көптеген иммундық факторларды тудыруы мүмкін және бұл факторлар тіндерге үздіксіз әсер еткенде, олар сигнализацияның өзгеруіне әкелуі мүмкін43. Бұл зерттеуде IL-4, IL-17 және IFN-γ артық экспрессиясы типтік иммундық факторлар болып табылады, бұл NP және MCs44 арасындағы тығыз байланысты одан әрі дәлелдейді. Бұл жануар үлгісі NP серпілісін және соңғы пластинаға кіруін жақсы еліктейді. Бұл процесс аутоиммунитеттің МК-ға әсерін одан әрі ашты.
Күтілгендей, бұл жануар үлгісі бізге MC зерттеуге мүмкіндік береді. Дегенмен, бұл модельде әлі де кейбір шектеулер бар: біріншіден, жануарларды бақылау кезеңінде кейбір аралық сатыдағы қояндарды гистологиялық және молекулалық биологияны тексеру үшін эвтанизациялау қажет, сондықтан кейбір жануарлар уақыт өте келе «пайдаланудан қалады». Екіншіден, осы зерттеуде үш уақыт нүктесі қойылғанымен, өкінішке орай, біз тек бір типті МК (I түрінің модикалық түрін өзгерту) модельдедік, сондықтан бұл адамның ауруының даму процесін көрсету жеткіліксіз, және көбірек уақыт нүктелерін орнату қажет. барлық сигнал өзгерістерін жақсырақ бақылаңыз. Үшіншіден, ұлпа құрылымындағы өзгерістерді гистологиялық бояу арқылы нақты көрсетуге болады, бірақ кейбір арнайы әдістер осы модельдегі микроқұрылымдық өзгерістерді жақсырақ аша алады. Мысалы, поляризацияланған жарық микроскопиясы қоянның омыртқааралық дискілеріндегі талшықты шеміршектердің түзілуін талдау үшін пайдаланылды45. NP-нің MC және соңғы пластинаға ұзақ мерзімді әсері қосымша зерттеуді қажет етеді.
Елу төрт еркек Жаңа Зеландиялық ақ қояндар (салмағы шамамен 2,5-3 кг, жасы 3-3,5 ай) кездейсоқ түрде жасанды операция тобына, бұлшықет имплантациясы тобына (ME тобы) және жүйке түбірлерін имплантациялау тобына (NPE тобы) бөлінді. Барлық эксперименттік процедураларды Тяньцзинь ауруханасының Этика комитеті мақұлдады және эксперименттік әдістер бекітілген нұсқауларға сәйкес қатаң түрде жүргізілді.
S. Sobajima 46 хирургиялық техникасына кейбір жақсартулар енгізілді. Әрбір қоян бүйірлік жату жағдайына орналастырылды және бес қатарлы бел омыртқааралық дискілерінің (IVDs) алдыңғы беті постеролатеральды ретроперитонеальді тәсіл арқылы ашылды. Әрбір қоянға жалпы анестезия берілді (20% уретан, құлақ венасы арқылы 5 мл/кг). Қабырғалардың төменгі жиегінен жамбас шетіне дейін, паравертебральды бұлшықеттерге дейін 2 см вентральды бойлық тері тілігі жасалды. Оң жақ anterolateral омыртқа L1-ден L6-ға дейінгі тері астындағы тіндердің, ретроперитонеальды тіндердің және бұлшықеттердің өткір және доғал диссекциясы арқылы ашылды (6А-сурет). Диск деңгейі L5-L6 дискінің деңгейі үшін анатомиялық белгі ретінде жамбас жиегін пайдалану арқылы анықталды. L5 омыртқасының шеткі пластинасының жанында 3 мм тереңдікте тесікті бұрғылау үшін 16 калибрлі пункциялық инені пайдаланыңыз (Cурет 6B). L1-L2 омыртқа аралық дискідегі аутологиялық пульпоздық ядроны сору үшін 5 мл шприцті пайдаланыңыз (6С-сурет). Әрбір топтың талаптарына сәйкес пульпозды немесе бұлшықетті алып тастаңыз. Бұрғылау тесігі тереңдетілгеннен кейін операция кезінде омыртқа денесінің периостальды тінін зақымдамау үшін терең фасцияға, беткі фасцияға және теріге сіңірілетін тігістерді салады.
(A) L5-L6 дискі артқы бүйірлік ретроперитонеальді тәсіл арқылы ашылады. (B) 16-габаритті инені L5 соңғы тақтайшасының жанында тесіңіз. (C) Аутологиялық МҚ жиналады.
Жалпы анестезия 20% уретанмен (5 мл/кг) құлақ венасы арқылы енгізілді, бел омыртқасының рентгенографиясы операциядан кейінгі 12, 16 және 20 аптада қайталанды.
Қояндар операциядан кейін 12, 16 және 20 аптада кетаминді (25,0 мг/кг) және тамыр ішіне натрий пентобарбиталын (1,2 г/кг) бұлшықет ішіне енгізу арқылы құрбандыққа шалынды. Гистологиялық талдау үшін бүкіл омыртқа алынып, нақты талдау жасалды. Иммундық факторлардағы өзгерістерді анықтау үшін сандық кері транскрипция (RT-qPCR) және Western blotting қолданылды.
МРТ зерттеулері ортогональды аяқ-қолды қабылдағышпен жабдықталған 3,0 Т клиникалық магнитті (GE Medical Systems, Florence, SC) пайдаланып қояндарда жүргізілді. Қояндар құлақ венасы арқылы 20% уретанмен (5 мл/кг) жансыздандырылды, содан кейін бел аймағы диаметрі 5 дюймдік дөңгелек беттік орамға (GE Medical Systems) орталықтандырылған магнитке жатқызылды. L3–L4-тен L5–L6-ға дейін бел дискінің орнын анықтау үшін корональды T2-өлшенген локализатор кескіндері (TR, 1445 мс; TE, 37 мс) алынды. Сагиттальды жазықтықтың T2 өлшенген кесінділері келесі параметрлермен алынды: қайталану уақыты (TR) 2200 мс және жаңғырық уақыты (TE) 70 мс, матрица бар жылдам айналдыру-эхо тізбегі; 260 және сегіз ынталандырудың көру өрісі; Кесу қалыңдығы 2 мм, алшақтық 0,2 мм болды.
Соңғы фотосурет түсіріліп, соңғы қоян өлтірілгеннен кейін, гистологиялық зерттеу үшін жасанды, бұлшықетке салынған және NP дискілері алынды. Тіндерді 10% бейтарап буферлі формалинге 1 апта бойы бекітіп, этилендиаминтетрасірке қышқылымен декальцификациялады және парафинмен кесінді. Тіндердің блоктары парафинге ендірілген және микротомды пайдаланып сагитальді бөліктерге (қалыңдығы 5 мкм) кесілген. Бөлімдер гематоксилинмен және эозинмен (H&E) боялған.
Әрбір топтағы қояндардан омыртқааралық дискілерді жинағаннан кейін жалпы РНҚ өндірушінің нұсқауларына және ImProm II кері транскрипция жүйесіне (Promega Inc. , Мэдисон, WI, АҚШ). Кері транскрипция жасалды.
RT-qPCR өндірушінің нұсқауларына сәйкес Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., АҚШ) және SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МО, АҚШ) көмегімен орындалды. ПТР реакциясының көлемі 20 мкл болды және оның құрамында 1,5 мкл сұйылтылған кДНҚ және әрбір праймердің 0,2 мкм болды. Праймерлерді OligoPerfect Designer (Invitrogen, Валенсия, Калифорния) әзірлеген және Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Қытай) өндірген (1-кесте). Келесі термиялық цикл шарттары қолданылды: бастапқы полимеразаны 94°C температурада 2 минут бойы белсендіру қадамы, содан кейін шаблонды денатурациялау үшін 94°C температурада әрқайсысы 15 секундтан тұратын 40 цикл, 60°C температурада 1 минут бойы жасыту, ұзарту және флуоресценция. өлшеулер 72°C температурада 1 минут бойы жүргізілді. Барлық үлгілер үш рет күшейтілді және орташа мән RT-qPCR талдауы үшін пайдаланылды. Күшейту деректері FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, АҚШ) көмегімен талданды. IL-4, IL-17 және IFN-γ генінің экспрессиясы эндогендік бақылауға (ACTB) қалыпқа келтірілді. Мақсатты мРНҚ-ның салыстырмалы экспрессия деңгейлері 2-ΔΔCT әдісі арқылы есептелді.
Жалпы ақуыз RIPA лизис буферінде (құрамында протеаза және фосфатаза ингибиторы коктейлі бар) тіндік гомогенизаторды пайдаланып тіндерден экстракцияланды, содан кейін ұлпа қалдықтарын жою үшін 4°C температурада 20 минут бойы 13 000 айн/мин центрифугалады. Әр жолаққа 50 микрограмм белок жүктеліп, 10% SDS-PAGE арқылы бөлініп, содан кейін PVDF мембранасына ауыстырылды. Бөлме температурасында 0,1% Tween 20 бар Tris-буферленген тұзды ерітіндіде (TBS) 5% майсыз құрғақ сүтте блоктау орындалды. Мембрана қоянға қарсы декориннің бастапқы антиденесімен (1:200 сұйылтылған; Бостер, Ухань, Қытай) (1:200 сұйылтылған; Биосс, Пекин, Қытай) түнде 4°C температурада инкубацияланды және екінші күндері реакцияға түсті; екіншілік антиденемен (1:40 000 сұйылтуда ешкіге қарсы қоянға қарсы иммуноглобулин G) желкек пероксидазасымен (Бостер, Ухань, Қытай) біріктірілген бөлме температурасында 1 сағат. Вест-блот сигналдары рентгендік сәулеленуден кейін хемилюминесценттік мембранадағы хемилюминесценцияның жоғарылауымен анықталды. Денситометриялық талдау үшін дақтар сканерленді және BandScan бағдарламалық құралы арқылы сандық мәндері анықталды және нәтижелер мақсатты геннің иммунореактивтілігінің тубулиннің иммунореактивтілігіне қатынасы ретінде көрсетілді.
Статистикалық есептеулер SPSS16.0 бағдарламалық пакеті (SPSS, АҚШ) арқылы орындалды. Зерттеу барысында жиналған деректер орташа ± стандартты ауытқу (орташа ± SD) ретінде көрсетілді және екі топ арасындағы айырмашылықтарды анықтау үшін дисперсияның бір жақты қайталанатын өлшемдерін талдау (ANOVA) арқылы талданды. P < 0,05 статистикалық маңызды деп саналды.
Осылайша, омыртқа денесіне аутологиялық NP имплантациялау және макроанатомиялық бақылау, МРТ талдау, гистологиялық бағалау және молекулалық биологиялық талдау жүргізу арқылы МК жануарларының моделін құру адамның МК механизмдерін бағалау және түсіну және жаңа терапиялық әдістерді әзірлеу үшін маңызды құрал болуы мүмкін. араласулар.
Бұл мақаланы қалай келтіруге болады: Han, C. et al. Модикалық өзгерістердің жануар үлгісі бел омыртқасының субхондральды сүйегіне аутологиялық пульпозды имплантациялау арқылы құрылды. Ғылым. Өкіл 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., and Boos, N. Магниттік-резонансты бейнелеу бел омыртқасы: диск грыжасының және ұстап қалудың таралуы, жүйке түбірінің қысылуы, соңғы пластинаның ауытқулары және симптомсыз еріктілерде фасеттік буын остеоартриті . мөлшерлемесі. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS және Leboeuf-Eed, K. Modic өзгерістері және олардың клиникалық нәтижелермен байланысы. Еуропалық омыртқа журналы: Еуропалық омыртқа қоғамының, Еуропалық омыртқалық деформация қоғамының және Еуропалық мойын омыртқасын зерттеу қоғамының ресми басылымы 15, 1312-1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Куисма, М., т.б. Бел омыртқасының соңғы пластиналарындағы модикалық өзгерістер: орта жастағы ер жұмысшыларда бел ауруы мен сіатиканың таралуы және ассоциациясы. Омыртқа 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
де Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., and Dalinka, M. MRI сүйек кемігін МРТ бел омыртқасының дегенеративті ауруында соңғы пластинаның жанында өзгереді. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Модик, МТ, Стейнберг, ПМ, Росс, Дж.С., Масарык, ТДж және Картер, ДжР Дегенеративті диск ауруы: МРТ көмегімен омыртқа кемігінің өзгерістерін бағалау. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Модик, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS және Carter, JR Дискінің дистрофиялық ауруының кескіні. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Дженсен, Т.С., т.б. Жалпы популяциядағы неовертебральды соңғы пластинаның (Модик) сигналдық өзгерістерінің болжаушылары. Еуропалық омыртқа журналы: Еуропалық омыртқа қоғамының, Еуропалық омыртқалық деформация қоғамының және Еуропалық мойын омыртқасын зерттеу қоғамының ресми басылымы, бөлім 19, 129-135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Альберт, HB және Mannisch, K. Модич бел жарығынан кейін өзгереді. Еуропалық омыртқа журналы: Еуропалық омыртқа қоғамының ресми басылымы, Еуропалық омыртқалық деформация қоғамы және Еуропалық мойын омыртқасын зерттеу қоғамы 16, 977-982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., and Kaapa, E. Modic I түріндегі өзгерістер тез прогрессивті деформациялық дискінің деградациясын болжай алады: 1 жылдық перспективалық зерттеу. Еуропалық омыртқа журналы 21, 1135-1142, doi: 10.1007 / s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ және Fan, SW Modic өзгерістері: мүмкін себептері және бел дискінің дегенерациясының үлесі. Медициналық гипотезалар 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Ішкі дискінің жарылуы. 50 жылдан астам диск пролапс проблемалары. Омыртқа (Phila Pa 1976) 11, 650-653 (1986).
Жіберу уақыты: 13 желтоқсан 2024 ж